EKSPERİMENTAL MEXANİKİ SARILIĞIN 7-Cİ VƏ 10-CU GÜNLƏRİNDƏ QARACİYƏRDƏ BAŞ VERƏN DƏYİŞİKLİKLƏRİN HİSTOLOJİ VƏ ELEKTRON MİKROSKOPİK XARAKTERİSTİKASI

06-02-2017

Acar sözlər mexaniki sarılıq, hepatosit, nekroz, apoptoz.

Mexaniki sarıılıq zamanı müzakirə olunan məsələlər arasında, ən qabarıq nəzərə çarpan, hepatositlərin ölüm formaları və onların baş vermə səbəbləri haqqında fikir birliyinin olmamasıdır. Əldə olan məlumatların bir qismində hepatositlərin ancaq proqramlaşmış ölüm forması sayılan –apoptoz yolu ilə [1-5], digərlərində isə, birmənalı olaraq, mexaniki sarılıq zamanı qaraciyər hüceyrələrinin ölumü  nekroz vastəsi ilə baş verdiyi göstərilir [6-9]. Əldə olunan məlumatların səthi analizi göstərir ki, hal hazırda hüceyrənin apoptoz üsulu ilə ölümü zamanı tam bir birinin üzərinə düşən morfoloji və biokimyəvi kriterilər aşkar edilməmişdir. Belə ki, kaspaza fermentinin aktivliyinə əsasən, hüceyrənin apoptoz üsulu ilə ölümü təsdiqlənsə də, morfoloji olaraq apoptotik cisimciklərin aşkar edilməməsi dəqiq qərar verməkdə çətinlik törədir.

Hüceyrələrin apoptoz  adlandırılan ölüm forması haqqında ilkin məlumatlar Kerr və əməkdaşları tərəfindən aparılan histoloji və elektron-mikroskopik tədqiqatlara əsasən irəli sürül-müşdür[10]. O vaxtdan uzun müddət keçməsinə və hüceyrə ölümü formalarına aid hədsiz yeni məlumatların əldə olunmasına baxmayaraq, qeyd edilir ki, apoptozun müəyyən edilməsində qızıl standart hesab olunan elektron-mikroskopik tətqiqatlar nəticəsində müəyyənləşməlidir [11, 12].

Göstərilənləri nəzərə alaraq, aparılan işin məqsədi  eksperimental mexaniki sarılığın 7-ci və 10-cu günlərində  qaraciyərin parenximatoz və stromal elementlərində baş verən dəyişikliklərin histoloji və ultrastruktur səviyyədə tədqiqidir.

Tədqiqatın material və metodları.  Eksperimental tədqiqatlar hər iki cinsdən, çəkisi 180-220 qr. olan 30 ağ siçovullar üzərində aparılmışdır. Heyvanların individual nömrələri və qeydlər laborator tədqiqatlar protokollarında qeyd olunmuşdur. Heyvanlar vivariumda standart şəraitdə saxlanılmışdilar (hava temperaturu 22±2ºC, limitsiz su və yem istifadəsi). Bütün tədqiqatlar 18.03.1986 il eksperimental və digər elmi məqsədlər üçün istifadə olunan Onurğalı Heyvanların Müdafiəsi Avropa Şurası Konvensiyasına uyğun olaraq aparılmışdır [13].

Mexaniki sarılıq modeli ümumi narkoz altında təcrübə heyvanlarının ümumi öd axacağını tam bağlamaqla yaradılmışdır.

Ümumi anesteziya altında (kalipsol-0,5mq/kq)  siçovullarda laparotomiya aparılmışdır, qarın boşluğu orqanlari ayırd edilərək, ümumi öd axacağı seçilib, 4-0 ölçülü liqaturla tam bağlanılmışdır. Bundan sonra, qarin boşluğu orqanları yerlərinə diqqətlə yerləşdirilib, cərrahi yara qat qat tikilmişdir.

Heyvanlar 2 qrupa bölünmüşdurlər. 1 qrup (n=5) nəzarət qrupu idi (bu qrup heyvanlarda biokimyəvi müayinələr üçün qan götürülmüşdür, dekapitasiyadan sonra isə laparatomiya icra edilmişdir və qaraciyər toxumasından bioptat gotürülmüşdür), 2 qrup (təcrübə) (n=25) heyvanlarda isə öd axacağı bağlanaraq, mexaniki sarılıq modeli yaradılmışdır.Təcrübə qrupu heyvanları öz növbəsində 5 alt qrupa bölünmüşdür (hər birində 5 heyvan olmaqla). Bu yarımqruplara daxil edilən siçovullar sarılıq yaradıldıqdan sonra müvafiq olaraq onlarda 1, 3, 7, 10 və15 gün sonra biokimyəvi müayinələr üçün qan və histoloji müayinələr üçün bioptat göturmək məqsədi ilə dekapitasiya edilmişdir.Təqdim olunan məqalədə, MS yaradıldıqdan 7 və 10 gün sonra dekapitasiya edilmiş siçovulların qaraciyərindən götürülmüş bioptatların histoloji tədqiqi verilmişdir.

İstər nəzarət, istərsə də təcrübə qrup ağ siçovullardan götürülmüş qaraciyər tikələri fosfat buferində (pH 7,4) hazırlanmış 2%li paraformaldehid, 2%li qlütaraldehid və 0,1%li pikrin turşusundan ibarət məhlulda fiksasiya edilmişdir. İki saat ərzində fosfat buferində (pH 7,4) hazırlanmış 1% osmium turşusu məhlulunda postfiksasiya edildikdən sonra materialdan elektron mikroskopiyada qəbul olunmuş ümumi metodlarla Araldit-Epon blokları hazırlanmışdır. Bloklardan LKB-III, Leica EM UC7 ultratomlarında alınmış yarımnazik (1-2μm) kəsiklər metilen abısı, azur II və əsasi fiksinlə və ya toluoidin abısı ilə rənglənmiş, Latimet (Leitz) mikroskopunda baxılaraq lazımi hissələrin şəkilləri Pixera (ABŞ) rəqəmli fotokamerası ilə çəkilmişdir. Eyni bloklardan alınmış 70-100nm qalınlıqlı ultranazik kəsiklər əvvəlcə 2%-li uranil-asetat məhlulu, sonra NaOH-ın 0,1N qatılıqlı məhlulunda hazırlanmış 0,6%-li təmiz qurğuşun sitratla rənglənmişdir. Ultranazik kəsiklər 80-120 kv gərginlik altında JEM-1400 transmission elektron mikroskopunda tədqiq olunaraq elektronoqramlar çəkilmişdir.

Tədqiqatın nəticələri və onların müzakirəsi. Kəskin mexaniki sarılıq modelinin yaranmasının 7-ci günü 1-ci və 3-cü günlərlə müqayisədə mexaniki və distrofik xarakterli dəyişikliklərin daha qabarıq xarakter almaları istər mikroskopik, istərsə də ultrastruktur səviyyədə şəkil 1-də nümayiş etdirilmişdir. Şək. 1A-da göründüyü kimi, mikroskopik olaraq, sinusoidlərin divarının təşkilində iştirak edən hüceyrəvi elementlərin aşkar edilməmələri qanın qaraciyər tirlərin aralarında yaranmış xaotik xarakterli sahələrdə (S hərifi ilə nişanlanıblar) cərəyan etdiyini  göstərir. Göstərilənlərin əsas səbəbi, qara ciyər tirlərinin təşkilidə iştirak edən hepatositlərin sıxlaşmaları ilə yanaşı (şək. 1A-nın aşağı sol tərəfində), onların aralalarındakı əlaqələrin itirilməsi nəticəsində hepatositlərin sinusoidlər arasında “hasar” əmələ gətirmələrinin pozulmasıdır.

Ümumi öd axacağını bağladıqdan 7 gun sonra hepatositlərin sitoplazmasının danəvər quruluşa malik olması işıq mikroskopunun 500 dəfə böyüdücüsu altında belə (şək. 1A) aydın görünür. Ultrastruktur olaraq, qara ciyər hüceyrələrinin sitoplazmasının danəvər quruluşa malik olamalarının əsas səbəbi, ödem mayesinin toplanması nəticəsində həcmləri böyüdülmüş mitoxondrilərin saylarının istər perinuklear, istərsə də periferik zonalarda kəskin sürətdə artmalarıdır (şək.1B və 1C). Danəvər quruluşun qabarıq şəkildə nəzərə çarpmasında mitoxondrilərin xarici zarlarının bilavasitə yaxınlığında danəli endoplazmatik şəbəkə sisternalarının yerləşməsinin, onların sərhədlərinin asanlıqla aşkar edilməsinin rolunu da qeyd etmək lazımdır. Şək.1B-də nümayiş etdirilən elektronoqrammada, elektron açıq sahələrin hepatositlərin (şək.1B-də ulduzla işarə olunub) və onlarların yaxınlığında yerləşən öd axacaqlarının divarlarının təşkilində iştirak edən xolangiositlərin (şək.1C-də ulduzla işarə olunub) ətraflarında yerləşmələri ilə yanaşı quruluşca uyğun sahələrdə eritrositlərin aşkar edilmələri (şək.1B) qanın tərkib hissələrinin qaraciyər hüceyrələri ilə bilavasitə təmas etdiklərini göstərir. Qeyd etmək lazımdır ki, danəvər quruluşda olan sitoplazmaya malik hepatositlərə asinusların muxtəlif zonaları ilə yanaşı öd axacaqlarının ətrafında yerləşən hüdudi qaraciyər səfhələri daxilində də (şək. 1C) rast gəlinir. Şək. 1C-də nümayiş etdirilən elektronoqrammada oxla işarə olunmuş hissədə ətraf hüceyrələrdən nazik açıq sahələrlə ayrılmış və quruluşça onlardan fərqlənən iki hüceyrə görünür. Həmin nahiyyənin böyüdülmüş şəkillərinin (şək. 2A və 2B) tədqiqi göstərir ki, aşağıda yerləşən hüceyrələr, formasına, nuvə-sitoplazma münasibətinə və nüvənin periferik hissəsində nüvə dəlikləri kompleksində bir-birindən ayrılan heteroxromatinin ustünlük təşkil etməsinə görə, qara ciyər sinusioidlərinin daxilində yerləşən qara ciyərin təbii T-killer hüceyrələrinə (bu hüceyrələri qaraciyərin NK və Pit hüceyrələri də adlandırırlar) aiddirlər. Sitotoksik təsirə malik Pit hüceyrəsinin, yuxarıda yerləşən immunuloji sinapsları xatırladan əlaqə yaradaraq (şək. 2B), ondan yuxarıda yerləşmiş hepatositi, hüceyrə zarının tamlığının pozulması ilə müşahidə olunan, nekrotik dəyişikliyə məruz qoyduğu aydın görünür. Nekrotik dəyişikliklərə məruz qalmış hüceyrələrin ətrafinda deformasiyaya məruz qalmış eritrositlərin aşkar edilməsi (şək. 2C və 2Ç), onların da sinusoidlərin əhatəsində yerləşən hüceyrələrə aid olduqlarını göstərir. Nekrotik dəyişikliklərin inkişaf istiqamətlərindən və ultranazik kəsiklərin, əsasən hüceyrələrin periferik hissələrindən keçdikləri destruksiyaya məruz qalmış hüceyrələrin (şək. 2Ç) tiplərinin müəyyən etmək mümkün olmur.

Mexaniki sarılıq modelinin 7-ci günündə nekroza məruz qalmış tək-tək hüceyrələr, sinusoidlərin ətrafı ilə yanaşı, toplantı şəklində yerləşən, hepatositlər arasında da aşkar edilirlər. Şək. 2D-də beş, şək. 2E-də isə dörd ədəd eyni tipli hüceyrələrin əhatəsində yerləşən hepatositlərin nekroza məruz qaldıqı nümayiş etdirilmişdir. 2D-də hüceyrə zarlının tamlığının pozulması vakuoluzasiya ilə yanaşı, sitotomiya əlamətləri ilə müşahidə olunduğu halda, şək. 2E-də sito- və kariolizis əlamətləri üstünlük təşkil edirlər.

Kəskin xolestaz modelinin yaradılmasının 10-cu günündə qara ciyərdə baş verən istər mexanıkı, istərsə də destruktiv dəyişikliklərin daha da dərinləşdiyi aydın görünür. Nəzər diqqəti cəlb edən qara ciyər hüceyrələri tiplərininin histotopoqrafiyasinin qeyri müəyyən xarakter almaları, sinusoidlərin endotelio-makrofaqal örtüklərinin tam izlənilməməsi, hepatositlərin kicik damlalı steatozu, qaraciyər paycıqlarının periferik və ara zonalarında duktal metaplaziya (şək.3A), hepatositlərin hidropik distrofiyası və müxtəlif inkişaf mərhələsində olan nekroz ocaqları (şək.3B) və s. aşkar edilir.Nekrozla müşahidə olunan iltihabi hüceyrələrin (əsasən neytrofillərin, monositlərin, makrofaqların, fibroblastların və amorf toxuma detritinin) ilfiltrasiyası şəkil 4A-da və onun çərçivəyə alınmış hissələrinin böyüdülmüş fraqmentlərində (şək. 4B və şək. 5A və 5B) nümayiş etdirilmişdir. Paycıqaltı venanın divarının təşkilində iştirak edən və onun ətrafinda yerləşən, hüceyrəvi və fibrilyar struktulrlarla hepatosit səfhələri və iltihabi ilfiltrasiya arasında  odem mayesinin yerləşməsinə məxsus olan, rənglənməmiş sahələr yerləşir.  İnfiltrasiya  zonasında, iltihabi hüceyrələrlə paranekrotik dəyişikliyə məruz qalmış hepatositlər arasında yerləşən neytrofillərin özləri destruktiv dəyişikliklərə məruz qalırlar (şək. 5A-da oxla göstərilib).  Parenximanın nekroza məruz qalmaqda olan hissəsində, aktivləşmiş neytrofillərin ətrafında çox nüvəli hepatositlərin (şək. 5A-nın sağ yuxarı hissəsində) üstünlük təşkil etmələri, nekrotik və regenerativ proseslərin paralel getdiyini göstərir. Sonuncu proseslərin paralel getməsini, aktivləşmiş neytrofillərin iştirakı ilə nekroza uğrayaraq nüvələrini itirmiş, hepatositlərin (şək. 5B-də oxlarla göstərilib) çox nüvəli hüceyrələrin və xolangiositlər əhatəsində yerləşmələri də göstərilir.

Müzakirə olunan müddət ərzində eksperimental heyvanların bir qismində, hepatositlərdə kicik damlalı steatoz əlamətləri üctünlük təşkil etdiyi halda, digərlərində, degenerativ proseslərin dərinləşməsi nəticəsində, nekrozla nəticələnən hidropik distrofiya inkişaf edir. Qeyd etmək lazımdır ki, nekroz ocaqlarındakı hüceyrələrdə gedən dəyişiklilər o dərəcəyə catır ki, histoloji olaraq onların tiplərini müəyyənləşdirmək xeyli çətinləşir (şək. 6A). Həmin nahiyyələrin elektron mikroskopik şəkillərində nekroza məruz qalmış hüceyrələrin tam əksəriyyətinin hepatositlərə aid olduqları aydın görunür (şək. 6B və 6C). Digər tərəfdən, nəzər diqqəti cəlb edən hidropik distrofiyaya məruz qalmış hüceyrələrin tam əksəriyyətində sito- və kariolizis proseləri üstunluk təşkil etdiyi halda (şək.  6D və 6E ), ümumən kollikvasyon nekroz fonunda superkondensasiyaya məruz qalmış nüvələrin (şək.7A və 7B) ayrı-ayrı fraqmentlərə parcalanması (karioreksis) müəyəyn edilir (şək. 7C və 7D). 

 Şək.1. Ümumi öd axacağını bağladıqdan 7 gun sonra hepatositlərin sitoplazmasının danəvər qurluşa malik strukturların işıq (A) və elektron mikroskopik (B, C) şəkilləri. Izahı mətndə verilmişdir. A yarımnazik kəsik. Rəng. metilen abısı, B və  C ultranazik kəsiklər. Rəng.: uranil-asetat və təmiz qurğuşun citrat.  S-sinusoid, QcT-qaraciyər toxuması, H-hepatosit, Er-eritrosit, N-nüvə, ÖA-öd axacağı, HQcS-hüdudi qaraciyər səyfəsi, N-nüvə.

Şək 2. Mexaniki sarılıq modelinin 7-ci günündə nekroza məruz qalmış tək-tək hüceyrələrin elektron mikroskopik şəkilləri. Izahı mətndə verilmişdir.

A-F ultranazik kəsiklər. Rəng.: uranil asetat və təmiz qurğuşun citrat. H-hepatosit, PH-Pit hüceyrəsi, N-nüvə, S-sinusoid.

Şək. 3 Xolestaz modelinin yaradılmasının 10-cu günündə qaraciyərdə duktal metaplaziya (A) və nekroz ocaqlarının (B) mikroskopik şəkilləri. Izahı mətndə verilmişdir. Yarımnazik kəsiklər.        Rəng. metilen abısı.

Şək. 4. Mexaniki sarılığın 10-cu günündə paycıqaltı vena ətrafinda nekrozla müşahidə olunan iltihabi hüceyrələrin infiltrasiyası (A) və çərçivəyə alınmış hissəsinin (B) böyüdülmüş fraqmenti. Izahı mətndə verilmişdir. Yarımnazik kəsiklər. Rəng. metilen abısı.

Sək.5 Şəkil 4A-da orta və yuxarı çərçivəyə alınmış hissələrinin böyüdülmüş fraqmentləri. Izahı mətndə verilmişdir. Yarımnazik kəsiklər. Rəng. metilen abısı.

Şək. 6. Ümumi öd axacağını bağladıqdan 10 gun sonra qaraciyərdə aşkar edilən ocaqlı nekrozun işıq (A) və həmin nahiyyədə yerləşən strukturların  elektron mikroskopik (B - E) şəkilləri. Izahı mətndə verilmişdir. A- yarımnazik kəsik. Rəng. metilen abısı, B - C ultranazik kəsiklər. Rəng.: uranil-asetat və təmiz qurğuşun citrat. QcT-qaraciyər trabekulası, H-hepatosit, KL-kariolizis, V-vakuol.

Şək.7 Xolestaz modelinin yaradılmasının 10-cu günündə ümumən kollekvasion nekroz fonunda hepatositlərin superkondensasiyaya məruz qalmış nüvələri (kariopiknoz- A və B)  və ayrı-ayrı fraqmentlərə parcalanmaları (karioreksis – C və D). BTE- birləşdirici toxuma elementləri, NP-nuvə parçaları, F-fibrosit,

Şək. 8. Ümumi öd axacağını bağladıqdan 10 gun sonra qaraciyərdə apoptotik nüvəyə xas olan nüvə örtüyü yaxınlığında superkondensasiyaya məruz qalmış  heteroxromatin toplantısı aşkar edilən hepatositlərin (A və B), plazmatık (C)  və endotel hüceyrələrinin (D)  2-ci tip nekroza məruz qalmalarının elektron mikroskopik şəkilləri. A- D  ultranazik kəsiklər. Rəng.: uranil-asetat və təmiz qurğuşun citrat.

Beləliklə əldə olunan faktiki materialın analizi göstərir ki, istər işıq, istərsə də elektron mikroskopik səviyyəıllərdə, kəskin eksperimenmal mexanıki sarılıq zamanı, qara ciyər hüceyrələrinin apoptoz yolu ilə ölümünə rast gəlinmir. Qeyd etmək lazımdır ki, apoptoz, proqramlaşmış ölüm forması kimi, hec bir patoloji dəyişikliyə uğramamış orqanların  hüceyrələri arasıda da müəyyən sayda təcrübə heyvanlarda rast gəlinməməsi, hər hansı bir patoloji dəyişikliyin əlaməti hesab olunmamalıdılr. Maraqlısı odur ki, tədqiqat obyektlərinin hec birində apoptotik cisimciklər aşkar edilməmişdir. Bununla birlikdə hepatositlərin (şək. 8A və 8B), plazmatik hüceyrələrin (şək. 8C) və endoteliositlərin (şək. 8D- nin mərkəzi hissəsində) nüvələrində, apoptozun əlamətlərindən biri sayılan, superkondensasiyaya  uğramış xromatin kütləsinin nüvələrin periferik hissələrində toplanmasına rast gəlınır. Ancaq həmin hüceyrlərin plazmolemmalarının tamlığının pozulması və orqanellərdə baş verən destruktiv dəyəşıkliklər onların apoptoza yox, 2-ci tip nekroza məruz qaldıqlarını  göstərir.

 

ƏDƏBİYYAT - ЛИТЕРАТУРА– REFERENCES:

 

1. Miyoshi H, Rust C, Roberts PJ, et. al., Hepatocyte apoptosis after bile duct ligation in the mouse involves Fas. // Gastroenterology. 1999 Sep;117(3):669-77.

2. Sodeman T, Bronk SF, Roberts PJ, et. al.,Bile salts mediate hepatocyte apoptosis by increasing cell surface trafficking of Fas.  // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2000 Jun; 278(6):G992-9.

3. Higuchi H, Bronk SF, Taniai M, et. al., Cholestasis increases tumor necrosis factor-related apoptotis-inducing ligand (TRAIL)-R2/DR5 expression and sensitizes the liver to TRAIL-mediated cytotoxicity. // J Pharmacol Exp Ther. 2002 Nov;303(2):461-7.

4. Schattenberg JM, Zimmermann T, Wörns M, et. al., Ablation of c-FLIP in hepatocytes enhances death-receptor mediated apoptosis and toxic liver injury in vivo. // J Hepatol. 2011 Dec;55(6):1272-80.

5. Wang K. Molecular mechanisms of hepatic apoptosis regulated by nuclear factors. // Cell Signal. 2015 Apr;27(4):729-38.

6. Nalapareddy Pd, Schüngel S, Hong JY, et. al., The BH3-only protein bid does not mediate death-receptor-induced liver injury in obstructive cholestasis. // Am J Pathol. 2009 Sep;175(3):1077-85.

7. Mitchell C, Mahrouf-Yorgov M, Mayeuf A, et. al.,  Overexpression of Bcl-2 in hepatocytes protects against injury but does not attenuate fibrosis in a mouse model of chronic cholestatic liver disease. // Lab Invest. 2011 Feb;91(2):273-82.

8. Woolbright BL, Antoine DJ, Jenkins RE, et. al., Plasma biomarkers of liver injury and inflammation demonstrate a lack of apoptosis during obstructive cholestasis in mice. // Toxicol Appl Pharmacol. 2013 Dec 15;273(3):524-31.

9. Woolbright B.L, Dorko K., Antoine D.J., et al. Bile acid-induced necrosis in primary human hepatocytes and in patients with obstructive cholestasis. // Toxicol Appl Pharmacol. 2015 Mar 15;283(3):168-77.

10. Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. // Br J Cancer. 1972 Aug;26(4):239-57.

11. Taatjes D.J., Sobel B.E., Budd R.C. Morphological and cytochemical determination of cell death by apoptosis. // Histochem Cell Biol. 2008 Jan;129(1):33-43.

12. Tinari A., Giammarioli A.M., Manganelli V., et. al.,  Chapter one analyzing   morphological and ultrastructural features in cell death. // Methods Enzymol. 2008;442:1-26.

13. European convention for protecnion of vertebrate  animals used for experimental and other scientific purposes. // Council of Europe. Strasburg.-1986.-53p.