ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АПОПТОЗА В КАНАЛЬЦЕВОМ ЭПИТЕЛИИ ПОЧКИ

27-02-2017

Апоптоз – занимает важное место в регуляции тканевого гомеостаза. Одной из основных функций апоптоза является уничтожение дисфункциональных клеток. Термин "апоптоз" впервые был употреблен в 1972 году британскими учеными Дж. Керре, Э.Уайли и А.Керри. Керри и его сотрудники морфологически прослеживая клеточную гибель обнаружили распад клеток на отдельные апоптотические тельца, отграничение плазмати-ческой мембраной, затем фагоцитирование их макрофагами. Апоптоз с греческого перевода означает "опадение листьев". Термин "апоптоз" употребленный Homer, выражающий “осеннее падение листьев”, имел цель подчеркнуть клеточную гибель.

В нормальном эмбриональном периоде апоптоз играет важную роль в фокальной делеции клеток. Во многих случаях исключая злокачественные новообразования важную роль в патогенезе играет апоптотическая гибель клеток. Известно об ослаблении, замедлении и даже остановке апоптоза при росте клеток злокачественных новообразований. При оценивании роста и регенерации важно соотношение между апоптозом и пролиферацией.

Апоптоз (запрограммированная гибель клеток) и некроз два важных процесса приводящих к гибели клеток. Апоптоз-механизм гибели клеток, особенно участвующих в гомеостазе и патогенезе [1, 2, 3].

          Как было сказано выше, апоптоз запрограммированная гибель клеток и независимо от органа, ткани или клетки происходит одним механизмом. Учитывая это апоптоз в печени, почке, селезенке или в других органах даст идентичную патогистологическую картину. Существует множество методов определения апоптоза. Самым существенным и точным исследованием является определение патоморфологическими красками. Известно, что причинами повреждения почек  во многих случаях являются аутоиммунные механизмы, ишемия и воздействия токсических веществ. Эти причины, сами по себе находятся в ряду причин ускоряющих запуск патологического апоптоза.

          Произошедшие при апоптозе первичные вндимые морфологические изменения, связанные  с конденсацией хроматинового вещества – уменьшение ядра и его распад и связанные с уменьшением объема цитоплазмы и конденсация белков цитоплазмы [4]. Через 2 часа после начала апоптоза на клеточной мембране образуются в форме выпячиваний на граничащей с мембраной  межклеточном пространстве "апоптотические тельца". Главная особенность этих телец – это покрытие подвергшихся фрагментации ядер и относящихся к клеткам частей, общей плазматической мембраной и неинформирование иммунной системе о местной воспалительной реакции [5]. Начало механизма апоптоза обеспечивают цистеин, протеиновые ферменты называемые каспазами [6]. Внутри клеток каспазы находятся в инактивированном состоянии. В основе одного из основных рецептор-зависимых путей апоптоза лежит Fas/FasL рецепторно-лигандная система. Эти рецепторы относятся к семейству TNF (англ.: tumor necroses factor receptor или TNFR) [9, 10, 11].

Другая мишень изучения механизма апоптоза это ген ретинобластомы. Rb – это первый найденный ген супрессор опухолей [7, 8]. Ген Rb – это один из фосфопротеинов, он супрессирует факторы транскрипции генов необходимых для перехода из фазы G в фазу S цикла клеточного деления и тем самым оставляя в фазе G. Нормальная клетка при переходе из фазы G  в фазу S фосфорилируя с помощью киназ Rb переводит его в неактивное состоя-ние.  Также в нормальном состоянии взаимодействие Rb и p53 регулирует рост числа клеток. При потере Rb его функции p53 активизирует процесс апоптоза [12, 13, 14, 15].

При апоптозе одна из мишеней белок Fodrin. Alfa Fodfin один из связанных с мембраной белков формирующих клеточный скелет. При апоптозе с началом каскада протеолитических ферментов разрушающих Fodrin, приводит к невозможности удержания связи между мембраной и клеточным скелетом и в связи с этим возникает так называемый "blebbing", участвует в разрушении мембран на новые маленькие частицы [16, 17]. На поверхности апоптотических клеток возникают новые сигнальные лиганды, с помощью которых они ликвидируются в межклеточном пространстве окружающими клетками методом фагоцитоза. Продолжительность этого процесса 2-5 часов [18, 19, 20].

Морфологические изменения связанные с апоптозом можно обнаружить с помощью светового и электронного микроскопов. Возможно, отчетливо видеть сморщивание клетки, разрыв цитоплазмы и ядерной мембраны, изменение локализации органелл и скопление хроматина.

Для определения апоптотических телец при гистологическом исследовании используют красители DAPI (4,6 Diamine 2, phenyl­indoledi­hydro­chloride) и эозин. DAPI специфичный краситель используемый при окрашивании ДНК. В связи с одиночным окрашиванием клеток в эксперименте получаются ограниченные позитивные результаты. Эозин – классический краситель. Связываясь с ДНК окрашивает ядра в красный цвет. При этом можно частично увидеть хроматин внутри апоптотических телец [20, 21, 25].

Для определения фрагментов ДНК существует другой метод ELISA с помощью которого, можно увидеть разрушенные в результате апоптоза и проникшие в цитоплазму моно или олигонуклеазы [22, 25].

Другой используемый для определения подвергшихся апоптозу клеток метод Anneksin V [23]. Для определения апоптоза этот метод применяется редко.

Для определения апоптоза в стадии фрагментации используется метод TUNEL (Terminal deoxynucleotidyle Transferase Biotin DUTP Nick End Labeling). В апоптотических клетках в связи с ускоренным разрушением цепей ДНК хроматин теряет целостность. При этом применяя световой или флюоресцентный микроскоп, возможно, увидеть маркированные биотином части ДНК. Метод TUNEL считается очень важным в изучении апоптоза. Это очень чувствительный тест. При этом можно определить даже единичные подвергшиеся апоптозу ядра [23, 24]. При окрашивании с помощью метода TUNEL в световом микроскопе при патоморфологическом оценивании можно наблюдать апоптотические клетки с синими ядрами [25].

При электронной микроскопии для обнаружения апоптоза, первично наблюдается разрыв десмосомальных связей, на второй стадии волнистое строение плазматической мембраны и маргинация хроматина. При описании электронных микроскопий маргинация хроматина считается специфичным признаком.

В результате обзора литературы можно понять апоптоз и его молекулярные механизмы регуляции и изучение методов регуляции апоптоза.

 

ƏDƏBİYYAT - ЛИТЕРАТУРА– REFERENCES:

 

1. Hu R, Zhai Q, Liu W, Liu X. An Insight into the Mechanism of Cytotoxicity of Ricin to Hepatoma Cell: Roles of Bcl-2 Family Proteins, Caspases, Ca2+-Dependent Proteases and Protein Kinase C. J. of Cellular Biochem 2001; 81: 583–593.

2. Wyllie AH. Glucocorticoid-induced thymocyte Apoptosis in Associated with Endogenous Endonuclease Activation. Nature 1980; 284 (5756): 555–556.

3. Hotchkiss RS, Swanson PE, Freeman BD. et al., Apoptotic cell death in patients with sepsis, shock, and multiple organ dysfunction. Crit Care Med 1999, 27:1230-1251.

4. Vermes I, Haanen C, Steffens-Nakken H, Reuteling sperger C. A Novel Assay for Apoptosis. Flow Cytometric Detection of Phosphatidylserine Expression on Early Apoptotic Cells Using Fluorescein Labelled Annexin V. J. Immunol. Methods 1995; 184:39–51.

5. Zou H, Henzel WJ, Liu X, et al., Apaf-1, a human protein hoınologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation ofcaspase-3. Cell 1997; 90:405-13.

6. Степанов Ю.М., Фильченков А.А., Кушлинский Н.Е. Система Fas/Fas-лиганд // Днепропетровск: ДНА. - 2000. - 48 с.

7. Cordeiro M.F., Migdal C., Bloom P., et al., Imaging apoptosis in the eye // Cell Death Dis. 2010. – Р. 51-62.

8. Farkas R.H., Grosskreutz C.L. Apoptosis, neuroprotection and retinal ganglion cell death // Int. Ophthalmol. Clin. – 2001. – Vol.41. – P. 111-130.

9. Rothstein T.L., Wang J.K., Panka D.J. et al., Protection against Fas-dependent Th1-mediated apoptosis by antigen receptor engagment in B cells // Nature. - 1995. – Vol. 374. – P. 163-165. 

10. Nagata S, Golstein P. The Fas death  factor. Science 1995; 267:1449-1456.

11.  Nicholson DW, Thomberry NA. Caspases: killer proteases. Trends Biochem Sci 1997; 22: 299-306.

12. Liano F, Pascual J. Epidemiology of acute renal failure: aprospective, multicenter, commu­nity-based study. MadridAcute Renal Failure Study Group. Kidney Int 1996; 50:811-8.

13. Srinivasula SM, Ahmad M, Fernandes Alnemri T. et al., Molecular ordering of the Fasapop­to­tic pathvay: the Fas/APO-1 protease Mch5 is aCrmA-inhibitable protease that activates multiple Ced-3/ICE-like cysteine proteases.Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93(25): 14486-14491.

14. Hirata H, Takahashi A, Kobayashi S, et al., Caspases are activated in a branchedprotease cascade and control distinct downstream processes in Fas-induced apoptosis. J. Exp. Med. 1998; 187:587-600.

15. Liu X, Kim CN, Yang J, et al.,  Induction of apoptotic program incell free extracts: requirement for dATP and cytochrome c. Cell, 1996; 86: 147-57.

16. Hassoun HT, Kozar RA, Kone BC, et al., Intra ischemic hypothermia differentially modulates oxidative stress proteins during mesenteric ischemia/reperfusion. Surgery 2002; 132:369-76.

17. Heijnen BHM, Straatsburg IH, Gouma DJ, van Gulik TM. Decrease in core liver temperature with 10°C by in situ hypothermic perfusion under total hepatic vascular exclusion reduces liver ischemia and reperfusion injury during partial hepatectomy inpigs. Surgery 2003;134: 806-17.

18. Lipponen P, Aaltomaa S, Koşma VM. Syrjanen K. Apoptosis in breast cancer asrelated to histopathological characteristics and prognosis. Eur J Cancer 1994; 14:2068-2073.

19. Ben-Hur H, Gurevich P, Huszar M. et al. Apoptosis and apoptosisrelatedproteins in the epithelium of human ovarian tumors: immunohistochemical andmorphometric studies. Eur J Gynaecol Oncol 1999; 20: 249-253.

20. Overbeeke R, Steffens-Nakken H, Vermes I, et al., Earlyfeatures of apoptosis detected by four different flow cytometry assays. Apoptosis 1998;3: 115-121.

21. Tesarik J, Greco E, Cohen-Bacrie P, Mendoza C. Germ cell apoptosis in men withcomplete and incomplete spermiogenesis failure. Mol Hum Reprod 1998; 4: 757-762.

22. Kockx MM, Muhring J, Knaapen MWM, de Meyer GRY: RNA synthesis andsplicing interferes with DNA in situ end labeling techniques used to detect apoptosis. AmJ Pathol 1998; 152(4): 885-888.

23. Gavrieli Y SY, Ben-Sasson SA. Identification of programmed celi death in situ viaspecifıc labelling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol 1992; 119: 493-501.

24. Cotter TG, Martin SJ. (1996) Techniques in Apoptosis (A User’s Guide). Portland Press, London.

25. Taatjes D., Sobel B., Budd R. Morphological and cytochemical determination of cell death by apoptosis // Hishochem. Cell Biol.-2008. – Vol. 129. – P.33-43.