SÜMÜK İLİYİ MƏNŞƏLİ MEZENXİMAL KÖK HÜCEYRƏLƏRİNİN HOMOLOJİ ASELLULYAR ƏZƏLƏ TRANSPLANTLARININ REGENERASİYASI PROSESİNƏ TƏSİRİ

22-06-2017

Açar sözlər: Satellit hüceyrələr, kök hüceyrələr, əzələ yamağı, əzələnin regenerasiyası, əzələnin fibrozu

Əzələ toxuması digər toxumalar kimi özünü yeniləmə, bərpa-regenerasiya qabiliyyətinə malikdir, regenerasiya hesabına həcmini artırır, hətta kiçik yaralanmalardan sonra əzələ hüceyrələri (lifləri) regenerasiya edərək zədələnmiş toxumanın anatomik-funksional tamlığını bərpa edir [1-3]. Əzələ toxumasının sağlam əzələ hüceyrələri hesabına regenerasiyasının, xüsusilə qeyri-əzələ mənşəli kök hüceyrələri tərəfindən stimulyasiyası məsələsinin gedişi kifayət qədər  öyrənilməmişdir.

Tədqiqatın məqsədi.Eksperimental əzələ defekti modellərində orqanizmin autoloji mezenximal kök hüceyrələri nümunələrini tətbiq etməklə əzələ toxumasının maksimal həcmlərdə regenerasiyasına nail olunması. 

Material və metodlar. Tədqiqat işi 2008-209-cu illərdə Türkiyə Respubli-kasının On Doqquz may Universitetinin (Samsun) Tibb fakultəsinin Cərrahi araş-dırma və tətbiqetmə  mərkəzində 300-350 q çəkili 20 dişi Sprague Dowley cinsli siçovul üzərində yerinə yetirilmişdir. Universitetin “Heyvan təcrübələri üzrə yerli etik qurumu” tədqiqatın aparılmasına rəsmi izn vermişdir. Cərrahi əməliyyatlar ümumi anesteziya (ketamin hidroxlorid (65 mg/kg)+xylazin hidroxlorid (0.65 mg/kg, əzələ daxilinə) altında eyni cərrahi briqada tərəfindən aparılmışdır.

Siçovulun sümük iliyi mənşəlli mezenximal  kök hüceyrə fraksiyasının hazırlanması.Tədqiqatınhüceyrə kulturası alınması mərhələsi Universitetin tibbi biologiya və genetika kafedrasının hüceyrə genetikası laboratoriyasında aparılmışdır. Efir inhalyasiyası ilə anesteziya altında donor təcrübə heyvanı öldürülmüş, bud və qamış sümüklərindən yuma üsulu ilə sümük iliyi alınmışdır.

Bu məqsədlə DMEM-LG besiyeri ilə yuyulmaqla və insulin inyektoru ilə hər heyvandan ümumilikdə 10 ml smük iliyi götürülmüşdür. Tərkibində DMEM-LG olan hüceyrələr bərabər həcmdə boruşəkilli qaba, Ficoll məhlulu üzərinə yayıldı. Mononuklear hüceyrələri ayırmaq üçün “dansite gradient” üsulu ilə məhlul 30 dəq. müddətində sentrifuqa edildi. I fazadan toplanılmış mononuklear hüceyrələrdən ibarət tərkibin 3 ml-i axım sitometri cihazında hematopoetik və mezenximal kök hüceyrələri (MKH) hesab edildi. CD11 b/c,  CD45,  CD90,  CD106,  CD44  istifadə olunmaqla CD11b/c [97% (+)], CD45 [99% (+)], CD90 [34% (+)],  CD106 [11% (-)],  CD44 [1% (-)] kəmiyyətləri hesablandı.

Homoloji asellulyar əzələ skeletinin hazırlanması. Pararektal kəsiklə dərialtı qat ayrılmış, ağ xətt mobilizə olunmuş və düz əzələlər əldə edilmişdir. Müvafiq ölçmələr və işarələmələrdən sonra sağ düz əzələ seqmenti bütün qatlarla birgə blok şəkilində kəsilmişdir. Əzələ blokları növbə ilə 1 dəq. maye azotla dondurulmuş, sonra həmin müddətdə qaynar suda saxlanılmışdır. Bu prosedur 3 dəfə təkrarlanmış və  əzələ parçasında əzələ hüceyrələri məhv olmuşdur.  Əzələ skeletinin əvvəlki ölçülərini saxlaması üçün o, plastik lövhə üzərinə tarım yerləşdirilmiş və bütün küncləri bərkidilmişdir.

Eksperimental tədqiqatın xarakterinə və məqsədinə uyğun hər birində 5 siçovul olmaqla 4 seriyada təcrübə modelləri yaradılmışdır. Bütün seriyalarda m. rectus abdominis dex. əzələsinin 32x6 mm ölçülü defekti yaradılmış və defekt sahəsinə həmin əzələ skeleti təkrar tikilmişdir (şək. 1). I seriyada  (kontrol seriya) defekt nahiyəsinə yalnız asellulyar əzələ skeleti təkrar tikildi; IIvə III seriyada defekt nahiyəsinə cansızlaşdırılmış əzələ parçası tikildikdən sonra ona, III seriyada əzələ yamağına və tikiş xəttinin ətrafında ətraf sağlam əzələ toxumasına - 5%-li 0.3 ml Marcaine (Bupivacaine) məhlulu, IVseriyada defekt bölgəsinə tikilmiş asellulyar əzələ yamağına bir neçə nöqtədən sümük iliyindən alınmış MKH fraksiyası inyeksiya olundu (şək. 2).

 

Şək. 1. Eksiziya edilmiş əzələ toxuması blokunun uyğunlaşdırıldıqdan sonra öz yerinə tikilməsi

                   

                                             A                                                                          B

 

Şək. 2. IVseriyada cərrahi əməliyyatın mərhələləri:

A – 32x6 mm-lik aselulyar əzələ toxumasına mezenximal   kök hüceyrələrin implantasiyası;

B - homoloji asellulyar  əzələ skeletinin implantasiya sonrası görünüşü

Histopatoloji və imunohistopatoloji müayinələr. 4 həftə təqibdən sonra ümumi anesteziya altında əzələ yamağı, ətrafı sağlam əzələ toxuması ilə birgə düz-bucaqlı formada bütün qatlarla blok şəkilində kəsildi. Preparatlar stromal vaskulyar fraksiya suspenziyası ilə isladılmış steril bez üzərinə yerləşdirilərək histopatoloji müayinələr üçün bloklar hazırlandı və -70⁰C-də maye azotda donduruldu. Myosin Heavy Chain (developmental) (NC1-MHCd, IgG₁, NovcCastra) anticismi ilə yeni əmələ gəlmiş əzələ liflərinin varlığını aşkar (inkar) etmək üçün immunohistokimyəvi tədqiqat aparıldı. Boyayıcı agent kimi tərkibində 3,3’-diamino-benzidin (DAB) olan dəst (DAKO, Carpinteria, USA) istifadə edildi. Sonda kəsiklər Mayer hematoksilin-eozinlə 60 san. ərzində boyandı. Boyanmanın dəyərləndirilməsi prosesində əzələ hüceyrələrinin sarkolemmasının boyanması nəzərə alındı. İşıq mikroskopu altında müxtəlif böyütmə rejimlərində ilkin müayinələr aparıldı. Fibrozlaşmış bölgələr və əzələ toxuması regenerasiya olunmuş sahələr təsbit edildi.

Image J proqramı ilə fibroz sahələrinin hesablanılması. Histoloji şəkillərin dəyərləndirilməsi mikroskopa bağlanmış kamera ilə çəkilmiş filmlərin kompüterə köçürülməsi və xüsusi proqram təminatı ilə hesablamaların aparılmasına əsaslanmışdır. Mikroskopa bağlı rəqəmsal fotoaparatla çəkilmiş mikroşəkillər “jpg” formatında kompüterə köçürüldükdən sonra ödənişsiz əsaslarla on-lyne rejimində Image J proqramı ilə mikroşəkillərdə fibrozlaşmış və sağlam əzələ toxuması sahələri işarələnməklə hesablanmış və alınmış riyazi kəmiyyət sahə vahidinə (mm²) çevrilmişdir.

Statistik hesablamalar və analiz. Image J proqramı ilə materialların sahə ölçüləri  hesablandıqdan sonra onlar (fibroz sahələri və əzələ regenerasiyası baş vermiş sahələr) arasında müqayisə aparıldı. Kruskal-Wallis və Bonferoni düzəltməli Mann-Whitney (U) testləri ilə seriyalar arasında fərqin etibarlılığı dəyərləndirildi. Bu prinsiplə ən çox regenerasiya olmuş əzələ lifləri ilə və ən az fibrotik toxuma ilə sağalmış təcrübə seriyaları təsbit edildi.

Nəticələr və onların müzakirəsi.

Vizual (makroskopik) müayinələrin nəticələri.Bəzi nümunələrdəcərrahi sahədə infeksiyalaşma, irinləmə, tikişlərin tutarsızlığı, herniasiya, çapıqlaşmanın xarakteri və səviyyəsi, əzələ seqmentinin xarakterik dəyişiklikləri (qısalması, büzüşməsi, atrofiyası, sklerozu), toxumanın sərtləşməsi (indurasiyası, infiltrasiyası) kimi patoloji hallar müəyyən edildi. Nümunələrdə əzələ yamağının regenerasiya etmiş və fibrozlaşmış sahələri ətraf sağlam əzələ toxuması ilə intim birləşmişdir.

Şək. 3. Iseriya. Hematoksilin-eozinlə boyanmış preparatın mikrogörünüşü:

sarı oxlar - sağlam  əzələ toxuması ilə regenerasiya olunmuş sahələr, ağ oxlar- kobud fibrozlaşma sahələri və fibroblast topaları

Vizual (makroskopik) müayinələrin nəticələri. Bəzi nümunələrdəcərrahi sahədə infeksiyalaşma, irinləmə, tikişlərin tutarsızlığı, herniasiya, çapıqlaşmanın xarakteri və səviyyəsi dəyişiklikləri, əzələ seqmentinin xarakterik dəyişiklikləri (qısalması, büzüşməsi, atrofiyası, sklerozu), toxumanın sərtləşməsi (indurasiyası, infiltrasiyası) kimi patoloji hallar müəyyən edildi. Nümunələrdə əzələ yamağının regenerasiya etmiş və fibrozlaşmış sahələri ətraf sağlam əzələ toxuması ilə intim birləşmişdir.

Histopоtoloji və immunohistokimyəvi müayinələrin nəticələri. I seriyanın təcrübələrinin (kontrol seriya) nəticələrinə görə əzələ yamağının 66,62%-i fibroz toxuma, 33,8%-in  yeni yaranmış sağlam əzələ lifləri (toxuması) ilə  sağalmışdır (şək. 3). Fibrozlaşma ilə sağalma mərhəlsinin qarşısı tam alınmasa da yamağın ⅓ hissəsinin sağlam əzələ toxuması ilə regenerasiyası anestetik yeridilmiiş II seriyanın (şək. 4) nəticələri ilə (fibrozlaşmış sahələr 94,72%, regenerasiya olunmuş sahələr 5,28%) qarşılaşdırıldıqda nəticələr ümüdverici hesab edilmişdir.

 

Şək. 4. IIseriya (MHCd ilə boyanma). İmmunohistokimyəvi müayinə:

Marcaine məhlulu yeridilmiş əzələ yamağında  yaxşı boyanmış və sağlam əzələ toxuması ilə regenerasiya etmiş sahələr (sarı oxlar), bəzi sahələrdə fibroblastların çoxluğu (ağ oxlar)

II və III seriyalarda məqsədimiz skelet əzələsi mənşəlli miqrasiya edəcək kök hüceyrələrini -  satellit hüceyrələri inaktivasiya etməklə yeni canlı mioblast-ların məhvinə nail olmaq, tədqiqatın sonrakı mərhələsində hüceyrəsiz əzələ yamağını sadəcə skelet (matriks) kimi istifadə etməkdən ibarət olmuşdur. Asellulyar əzələ yamağının sümük iliyi mənşəlli mezenximal kök hüceyrələri hesabına bərpasının, yəni faktik ölü əzələ toxumasının regenerasiyasının mümkünlüyünü təsdiq (inkar) etmək tədqiqat işinin növbəti istiqamətini təşkil etmişdir. IV seriyada defekt sahəsi, yəni əvvəlki yerinə uyğunlaşdırılaraq tikilmiş ölü əzələ skeletinin 85,48%-i fibrotik toxuma, 14,52%-i MKH hesabına regenerasiya etməklə sağalmışdır (şək. 5).

Bütün seriyalar arasında müqai-ysəli statistik işləmələr zamanı və seriyaların nəticələrinin bir-biri ilə müqayisəsində fibrozlaşma ilə sağalmış və sağlam əzələ toxuması ilə regenerasiya etmiş sahələr arasında etibarlı fərq qeyd edildi. Həmçinin II və I seriyalar, III və I seriyalar arasında statistik etibarlı fərq aşkar olunmadı. IV və I seriyalar arasında isə statistik etibarlı fərq müəyyən edildi (p<0,05).

Şək. 5. IVseriya: İmmunohisto-kimyəvi müayinədə (MHCd ilə boyanma):

Mezenximal  kök hüceyrələri yeridilmiş əzələ yamağında  sağlam əzələ lifləri ilə regenerasiya etmiş qalın sahələr (sarı oxlar), fibrozlaşma ilə sağalmış sahələr

(ağ oxlar)

Müzakirə.İnsan orqanizmində zədələnmiş, iltihaba uğramış toxumalar məxsusi kök hüceyrələri hesabına özlərini yeniləyir və bərpa edirlər. Kök hüceyrələri sümük iliyi, yağ toxuması, skelet əzələsi, göbək ciyəsi, dəri və qanda daha çox olur [4-5]. Miofibrillərinin bazal membranının altında yerləşən və əzələ zədələnməsi zamanı zədələnmiş bölgəyə miqrasiya edərək mioblastlara çevrilən satellit hüceyrələr skelet əzələsinin kök hüceyrələridir [6]. Bu hüceyrələrin özlərini yeniləməsi, in vitro və in vivo mühitlərdə mioblastlara proliferasiyası, in vivo şəraitində miofibrillərə çevrilməsi müəyyən olunmuşdur. Hətta qeyri-əzələ mənşəli kök hüceyrələrinin də satellit hüceyrələr kimi əzələlərin regenerasiyasında iştirakı öyrənilmişdir [4-6]. Gussoni E. et al. (20004) tədqiqatlarında sümük iliyi mənşəlli kök hüceyrələrinin miogenik potensialını təsdiq etmişlər [7]. Sümük iliyində kök hüceyrələri bütün nüvəli hüceyrələrin ümumi sayının kiçik hissəsini [8] təşkil edirlər (0,0001%). Buna baxmayaraq, siçovulun borulu sümüklərindən az miqdarda (10 ml) götürülmüş sümük iliyindən alınmış MKH hətta hüceyrəsizləşdirilmiş əzələ toxumasının regenerasiyasını stimulə etmiş, yeni toxumanın əhəmiyyətli səviyyədə fibrozlaşmasının qarşısının alınmasına səbəb olmuşdur.

Beləliklə, tamqatlı qarın əzələsi defektinin rekonstruksiyasında asellulyar əzələ skeleti və homoloji mezenximal kök hüceyrələri istifadə etdiyimiz təcrübə seriyasında digər modellərlə müqayisədə ən az fibroz toxuma inkişaf etmiş və defektin maksimal böyük hissəsi (təxminən 15%-i) regenerasiya etmiş sağlam əzələ lifləri ilə qapanmışdır.

Nəticələr:

1.Əzələ yamağının regenerasiya səviyyəsi mikrobiomühitdən – yamağın erkən müddətlərdə damarlanması, qanlanması, satellit (kök) və blast hüceyrələrin miqrasiyası səviyyəsindən asılıdır. 

2.İmplantasiyadan sonra əzələ yamağının əzələ lifləri hesabına regenerasiya səviyyəsinin maksimal artırılmasında (14,52%) onun içərisinə köçürülmüş sümük iliyi mənşəli kök hüceyrələrinin keyfiyətinin və sayının çoxluğu mühüm əhəmiyyət daşıyır.

 

ƏDƏBİYYAT - ЛИТЕРАТУРА– REFERENCES:

 

1.Ткачук В.А. Стволовые клетки и регенеративная медицина. - Москва. Макc-пресс, 2012. - 88 c.
2.Tülay İrez. Kök hücre araştırmalarında yeni gelişmeler //Celal Bayar Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü. 2. Ulusal Sağlık Bilimleri Lisansüstü öğrenci Kongresi. - 17-20 nisan 2014, Kongre özet kitabı. –s. 95-96
3.Ringe J., Kaps C., Burmester G.R., Sittinger M. Stem cells for regenerative medicine: advances in the engineering of tissues and organs. //Naturwissenschaften. - 2002 Aug; 89(8):338- 51. Epub 2002 Jul 23.
4.Allahverdiyev A.M., Köse C., Kaçar R., et. al., The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro //Advances in Materials Science and Engineering, 60. 2016.
5.Olga Nehir Öztel, Adil M.Allahverdiyev, Melahat Bağırova, et. al., Göbek kordon kanı kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinin izolasyonuna ve adaptasyonuna etki eden çeşitli fiziksel ve kimyasal faktörlerin incelenmesi //1.Kök hücre araştırmaları kongresi (Uluslararası katılımlı) 28 eylül-2 ekim 2011, Sapanca, Türkiye, Kongre abstrakt kitabı.–pp. 09, s. 195
6.Melike Ersöz, Adil M.Allahverdiyev, Melahat Bağırova, et.al., Göbek kordonundan mezenkimal kök hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu //1.Kök hücre araştırmaları Uluslararası kongresi. İstanbul. 2016
7.Gussoni E., Soneoka Y., Strickland C.D., et. al., Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation //Nature. - 401: 390-394, 1999.
8.Yamada Y., Ito K., Nakamura S. et al. Promising cellbased therapy for bone regeneration using stem cells from deciduous teeth, dental pulp, and bone marrow //Cell Transplant. - 2011; 20(7):1003-1013. doi: 10.3727 /096368910X539128