ÜRƏK ÇATIZMAZLIĞI OLAN XƏSTƏLƏRDƏ GENETİK POLİMORFİZMİN DƏYƏNDİRİLMƏSİ

18-07-2017

Müasir dövrdə ürək çatışmazlığının (ÜÇ) diaqnozunun və müalicəsinin bəzi aspektləri hələ də mübahisəli olaraq qalmaqdadır. ÜÇ olan xəstələrdə müalicə nəticəsində 1 il ərzində sağ qalma ehtimalı 50%-ə çatmışdır (1). Son onillikdə müalicənin nəticələrini yaxşılaşdırmaq məqsədilə qanda genetik amillərə xüsusən də spesifik genetik polimorfizmə nəzarət edilməyə başlanılmışdır (2,6,7,8,9,12,13). Bununla yanaşı ÜK sonrakı qısa müddətdə ölüm halının və bu xəstəliyin artma səbəbi İS müalicənin uyuşmazlığudur. ÜÇ olan xəstələrdə lazımi nəticə əldə edilmədikdə İS preparatlardan uzun müddət istifadə olunduğu üçün nefrotoksik təsirlər baş verir (2,12). Digər səbəb isə belə xəstələrdə inkişaf edən kar diovaskulyar xəstəliklərdir. Eyni zamanda insult, infeksiya və bədxassəli şişlər bu xəstə lərin həyatına ciddi mənfi təsir göstərir (5, 11). Bu fəsadların çoxu uzun müddət istifadə olunan İS  preparatlara görə ikincili inkişaf edir.

Preparatlara cavab reaksiyasının xəstələrdə fərqlilik göstərməsində  irsilik, or qan funksiyası, preparat təsiri və  xəstəliyin təbiəti bu fərqliliyi yaradan amillərdir. Preparata qarşı verilən cavabın fərdlər arasında fərqlilik göstərməyinin səbəbi dərmanı metabolizə edən fermentləri və ya dərmanı hüceyrə xaricinə daşıyan zülalları kodlaşdıran gen lərdəki polimorfizmlərdir. Fərdlər arasında preparatlara cavab reaksiyasının fərqliliyinin təqribən 20-95%-i genetik amillərdən asılı olduğu ehtimal olunur (6,7,8,13). Fərdlər arasında metabolik fərqlilikdən biri də genetik strukturdakı müxtəliflikdir.

Ona görə də  bu işdə əsas məqsəd  CYP3A5*3 (6986A>G)  rs776746,  CYP3 A5* 6  (14690 G>A)  rs10264272, CYP3A4*18  (-878T>C),CYP3A4*1B (-290 A> G)  gen lərinin polimorfizminin  genotip paylaşmasını  və allel tezliklərini tədqiq etməkdir.  

Material və metodlar  Tədqiqata ÜÇ olan 50 xəstə (əsas qrup) və 50 könüllü  sağlam şəxs (nəzarət qrup) daxil edilmişdir. Xəstələr klinikaya ÜÇ  diaqnozu ilə ürək transplantasiyasının tətbiq edildiyi və poliklinikaya müayinə üçün müraciət edən 160 xəstə arasından seçilmişdir. İş protokolu Ege Universitetinin Tibb Fakültəsinin Etik Heyəti tərəfindən təsdiqlənmişdir. Bütün xəstələrdən Helsinki bildirişinə müvafiq olaraq imzalı razılıq blankı alınmışdır. Əsas qrupuna yaş həddi 5-65 ( orta yaş həddi 37±15) arasında olan  39 kişi və 11 qadın daxil edilmişdir. Etioloji  olaraq 34 xəstədə genişləmiş kardio miopatiya, 16 xəstədə isə işemik kardiomiopatiya müəyyən edilmişdir. Xəstələrin yanaşı xəstəlikləri də nəzərə alınmışdır.  Nəzarət qrupuna isə son 2 il ərzində istənilən səbəbə görə müraciət edən və heç bir klinik-laborator patologiyası aşkar edilməyən   şəxslər seçilmişdir. Bu qrupa yaş həddləri 40-55 arasında olan 36 kişi, 14 qadın daxil edilmişdir. Gen polimorfizm paylaşmasının və allel tezliyinin aparılması üçün ÜK həyata keçiriləcək xəstələrdən və nəzarət qrupundan EDTA ilə 2 ml  periferik qan götürülmüşdür. Əldə olunan genomik DNT, 280 nm dalğa uzunluğunda Nano Drop (Thermo Scientific) rəqəmsal spektrofotometrdə ölçüldükdən sonra DNT 50 ng/mkl  200 mkl fizioloji məhlulda həll edilmişdir. Sonra bu DNT molekulunun kavitasiyası tətbiq edilmişdir. Bu məqsədlə elektroforezdə 2 mkl (100 ng) DNT molekulu elektroforez aparatı ilə  (EC 105 -EC Apparatus Corporation, <500mA) 30-40 dəqiqə ərzində gərginliyi 100 mV, 80 mA cərəyandan istifadə edərək 1%-lik aqaroza (Sigma ) gelindən keçirilmişdir. Geldəki DNT ultrabənövşəyi  transluminatorlu rəqəmsal Gel Görüntülü Sistemində  (SynGene, France) əks etdirilmişdir. Genotipləmə üzrə aparılan işlər Ron H.N.van Schaik və həm., Fukuen S. və həm.  PCR –RFLP metodu ilə həyata keçirilmişdir. Hər bir fərd üzrə genotip  təyin etmək üçün iki ayrı polimeraz zəncir reaksiyasından (PCR)  istifadə olunmuşdur. PCR Amplifikasiya materialı Etidium Bromurlu 2%-lik aqaroz gel elektroforezi ilə aparılmışdır. Elektroforezdən sonra genotipləmə Rəqəmsal Gel Görüntülü sistemində qeyd edilmişdir. Hər bir PCR amplifikasiya materialı əsas cüt  sayına əsasən qeyd edilmişdir.Genotipləmə üçün müsbət PCR materiallarına ferment prosedurası (RFLP)  tətbiq edilmişdir. RFLP proseduraları: CYP3A4 geni 3* allel polimorfizmi üçün PstI fermenti (New England Biolabs, Beverly, MA), 878C/T  polimor fizmi üçün HpaII  fermenti  istifadə olunmuşdur. PCR materialından 7 mkl, müvafiq tam pondan 1.5 mkl və 5U ferment olmaqla cəmi 15 mkl məhlulda 2 saatlıq 37⁰C inku basiya edilmişdir. Kəsiklərin götürüldüyü materiallarda genotipləmə aparmaq üçün 3%-lik NuSieve aqaroza geli ilə elektroforez  apardıqdan sonra  kəsiklərin götürüldüyü materialların Gel Görüntülü sistemində ultrabənövşəyi şüalandırıl ması aparılmışdır. Allellər üçün geno tiplər əsasən cüt ölçülərinə görə aparılmışdır.  Tədqiqatların statistik  analiz SPSS 14.0 standart versiya proqramı vasitəsi ilə aparıl mışdır. Hardy–Weinberg bərabərliyində genotip tezliklərindəki yayınmanı dəyərləndir mək üçün Ki-Kare analizindən istifadə edilmişdir.

Tədqiqatin  nəticəsi  və  onun  müzakirəsiCYP3A5*3 polimorfizmində, 13 AA homozigot (26%) və 37 AG heterozigot (74%) xəstə müəyyən edilmişdir (cəd.1). Daha çox AG genotipi xəstə qrupunda müşahidə edilmişdir. CYP3A5*3 (6986A>G) polimorfizmi, nəzarət qrupunda, AA genotipi 10 (20%) fərddə, AG genotipi isə 40 (80%) fərddə müəyyən edilmişdir. Sağlam fərdlərdə AG genotipi daha çox müşahidə edilmişdir. Nonexpressor GG (variant) genotipi sağlam fərdlərdə müşahidə edilməmişdir. G variant allel tezliyi, xəstələrdə 20%, nəzarət qrupunda 40% aşkar edilmiş dir. Ən azı  digər variant ilə *3 daşıyıcısı olan xəstələrin metabolizmi aşağı səviyyədədir və preparatın standart ilkin dozası bu xəstələrə aşağı verilə bilər. CYP3A5*6 polimorfiz mində, 48 AA homoziqot (96%) və 2 GA heteroziqot (4%) xəstə təyin edilmişdir (cəd.2).  AA genotipi olan xəstələrdə daha çox müşahi də edilmişdir. CYP3A5*6(14690 G>A) pol imorfizmi, nəzarət qrupunda, GG genotipi 50 (100%) fərddə müəyyən edilmişdir. AG ge notipi və nonexpressor genotip aşkar edilməmişdir. GG sağlam fərdlərdə daha çox müşa hidə edilmişdir.  A variant allel tez liyi, xəstələrdə 2%, nəzarət qru punda 0% təyin edilmiş dir.Ən azı digər variant ilə *6 daşıyıcısı olan xəstələrin metoboliz mi aşağı səviyyə dədir və preparatın standart ilkin dozası bu xəstələrə aşağı verilə bilər.

CYP3A5*18 polimorfizmdə, 49 TT homoziqot 98(%) və 1 GA heteroziqot    2(%) xəstə təyin edilmişdir (cəd. 3).  TT genotipi olan xəstələrdə daha çox müşahidə edilmişdir. CYP3A4*18 (-878T>C) polimorfizmi, nəzarət qrupunda, TT genotipi 50 (100 %) fərddə  müəyyənləşdirilmişdir. TC genotipi və nonexpressor CC genotipi müşahidə edilməmişdir. TT sağlam fərdlərdə daha çox müşahidə edilmişdir. T dəyişkən allel tezliyi xəstələrdə 1%, nəzarət qrupunda  təyin edilməmişdir.Ən azı digər variant ilə *18 daşıyıcısı olan xəstələrin metobolizmi aşağı səviyyədədir və preparatın standart ilkin dozası bu xəstələrə aşağı verilə bilər.   Bu işin əsasını farmokogenetika, İS preparatların əks təsirlərini azaltmaqla birgə te ravpetik təsir üçün lazımi dozanı təmin etmək təşkil edir.   CYP3A4*1B (-290A>G) poli -                                                                                                                                                                                                                      

Cədvəl  № 1.

Ürək  çatışmazlığı olan xəstələrdə və    sağlam insanlarda CYP3A5*3 (6986A>G) rs776746  polimorfizmi genotip paylaşdırılması və allel tezlikləri

Cədvəl  № 2.

Ürək çatışmazlığı olan xəstələrdə və sağlam insanlarda    CYP3A5*6 (14690 G>A)rs10264272 polimorfizmin genotip paylaşması və allel tezlikləri

CYP3A5*6(14690 G>A)rs10264272Polimorfizmi
Qruplar	Genotip paylaşması			Allel tezliyi
	GG	GA	AA	G	A
Xəstələrin  sayı  (n=50)	48	2	0	98	2
Müşahidə olunan tezlik,    (%)	96	4		98	2
Sağlam insanların sayı -nəzarət , (n=50	50	0	0	100	0
Müşahidə olunan tezlik, (%)	100			100

 

morfizmi tədqiqində AA genotipi 47 xəstədə (94%), AG genotipi 3 xəstədə (6%) müşa hidə edilmişdir, dəyişkən GG genotipi müşahidə edil məmişdir (cəd. 4). A alleli 97%, G alleli 3% xəstədə müəyyən edilmişdir. CYP3A4* 1B (-290A>G) polimorfizmi, nəzarət qrupunda, AA genotipi 46 (92%) fərddə və AG genotipi 4 (8%) fərddə təyin edilmişdir. Nonexpressor GG genotipi müşahidə edilməmişdir. Daha çox AA sağlam fərdlərdə müşa hidə edilmişdir. G dəyişkən allel tezliyi xəstədə 3%, nəzarət qrupunda 4% müəyyən ləş dirilmişdir(cəd. 4).Ən azı digər variant ilə *1B  daşıyıcısı olan xəstələrin    metobolizmi aşağı səviyyədədir və preparatın standart ilkin dozası bu xəstələrə aşağı verilə bilər. CYP3A4*1B (-290A>G) polimorfizmi tədqiqində AA genotipi 47 xəstədə (94%), AG genotipi 3 xəstədə (6%) müşahidə edilmiş, dəyişkən GG genotipi müşahidə edilməmişdir (cəd. 4). A alleli 97%, G alleli 3% xəstədə müəyyən edilmişdir. CYP3A4* 1B (-290A>G)  polimorfizmi, nəzarət qrupunda, AA genotipi 46 (92%) fərddə və AG geno tipi 4 (8%) fərddə təyin edilmişdir. Nonexpressor GG genotipi müşahidə edilməmişdir. Daha çox AA sağlam fərdlərdə müşahidə edilmişdir. G dəyişkən allel tezliyi xəstədə 3%, nəzarət qrupunda 4% müəyyənləşdirilmişdir(cəd. 4).Ən azı digər variant ilə *1B  daşıyıcısı olan   xəstələrin  metobolizmi aşağı səviyyədədir və preparatın standart ilkin dozası bu xəstələrə aşağı verilə bilər.   

Cədvəl  № 3.

Ürək çatışmazlığı olan xəstələrdə və  sağlam insanlarda   CYP3A4*18  (-  878T>C) polimorfizmin genotip paylaşması və allel tezlikləri heç şübhəsiz bu işlərdən

 

Cədvəl  № 4.

Ürək çatışmazlığı olan xəstələrdə və  sağlam insanlarda  CYP3A4*1B (-290A>G)   polimorfizmin   genotip paylaşması və allel tezlikləri 

 

İS müalicənin tətbiq edildiyi ortotopik ÜK həyata keçirildiyi 50 xəstədə  CYP3A4 və CYP3A5 genlərinin polimorfik birdən çox genlər ilə müalicəyə cavab və ya müqavimətə bağlı uyuşmazlığının və fəsadların yaranma mexanizmasına molekulyar aydınlıq gətirmək və xüsusilə əldə olunan nəticələrin ÜK əvvəl namizədlərdə əvvəl cədən hansı İS müalicənin daha məqsədəuyğun ola biləcəyi proqnozunu yaratmaq nəzərdə tutulur. ÜK xəstələri, faydalanmaqdadır və qan konsentrasiya monitorinqini, siklosporin və takrolimus kimi istifadəsi çətin maddələrin rasional istifadəsinə icazə verilmişdir.Bununla yanaşı ÜK əvvəl gen polimorfizm paylaşdırılması bilindiyi halda  İS müa licənin başlanğıc və davamlılıq dozalarının fərdi şəkildə verməsi,dozalarının fərdi şəkildə tənzimlənməsinə imkan verir. Eləcə də ÜK əvvəl namizədlər üçün genetik analizin aparı lması preparat dozalarının tənzimlənməsi və əks təsirlərinin azaldılmağı baxımından mü hüm əhəmiyyət kəsb edir.Farmakogenetikanın gələcək inkişafı, düzgün dərmanın istifadəsinin daha yaxşı təyin olunmasını, müvafiq başlanğıc dozasının seçilməsi və orqan transplantasiyasından sonra bu preparatlarınların istifadəsi əlaqələndirilən risk faktorunun fərdiləşdirilməsində mühüm əhəmiyyətə malikdır.

Beləliklə, ÜK xəstələrdə İS fərdiləşməsi və preparatların əks təsirlərinin aradan qaldırılmasında yeni bir yanaşma olub,  çoxlu dərman müalicələrinin kəskin uyuşmazlığını aşağı nisbətdə effektiv təsirə malik olduğunu, steroidsiz və ya sürətli steroid ilə müalicə müddətinin uzadılması hallarında xəstələrin fərdiləşməsi məsələsində inkişaf etmiş proqramlara rəhbərlik edəcək farmakogenetikadır. Genetik polimorfizm xüsusiyyətində olan fermentlərin müalicə müddətində bilinməsi müalicənin uyğun luğunu təmin etmək baxımından əhəmiyyətlidir. Fərdiləşdirilmiş dərman müalicəsində farmakokinetik, farmakodinamik və farmakogenetik faktorlar əsas rol oynayır. Kal sinorin inqibitorlarının sərf edilməsində əhəmiyyətli rol oynayan P450 fermentlərini kodlaşdıran genlərin və Mdr-1 polimorfizminin təyin olunması, bu İS optimal qan səviyyəsinə çatmağına, uyuşmazlıq və nefrotoksisit riskinin azaldılmasına kömək olacağı güman edilir. Çünki genotipləmə, pre-transplant qiymətləndirməsi müddətində ÜK zamanı mövcud nəticələr ilə həyata keçirilə bilir. Gələcəkdə məqsədimiz, bu xəstələrdə, tək mər hələdə bütün genlərin analizini təmin edən DNT-lərin dizayn edilməsidir. Bu avtomatik texnikaların istifadəsi, farmakogenomika, immuno genetika və spesifik komplikasiya larda iştirak edən genlərin təyin olunmasını ehtiva edən məlumatların müəyyənləş dirilməsini təmin edəcəkdir.Gələcəkdə ÜK xəstələri üçün kliniki farmakogenomikanın   tətbiqi belə xəstələr üçün mühüm əhəmiyyəti olacaqdır. ÜK  xəstələrində  İS fərdiləş məsinə və preparatların əks təsirlərinin ləğv edilməsinə ehtiyac duyulur ki, bu da farmako genetik tədqiqatların naliyyətləri ilə təmin oluna bilər. Polimorfizmlərdən *3, *6, *18 və *1B müxtəlif allellərindən ən az birinin təyin edildiyi xəstələrdə (heteroziqot və ya homoziqot) fərqli allel tipinə görə preparatın standart başlanğıc dozası konvensional dozadan aşağı və ya çox verilməlidir. Ancaq bizim araşdırmamızda müxtəlif allellərin ən az bir əlamətini daşıyan heç bir fakt aşkar edilməmişdir. 

Nəticə

1.Polimorfizmlərdən *3, *6, *18 və*1B müxtəlif allellərindən ən az birinin təyin edildiyi xəstələrdə (heteroziqot və ya homoziqot) fərqli allel tipinə görə preparatın standart başlanğıc dozası konvensional dozadan aşağı və ya çox verilməlidir.

2.Müxtəlif allellərin ən az bir əlamətini daşıyan heç bir fakt aşkar edilməmişdir.

3.ÜK əvvəl alıcı və donorun CYP3A4 və CYP3A5 gen polimorfizm paylanması bilindikdə İS müalicənin başlanğıc və davamlılıq dozalarının fərdi şəkildə tənzimlənməsi mümkündür.

4.Yüksək metabolik və aşağı metabolik allellərinin mövcud olduğu ÜK əvvəl namizədlər üçün genetik analizin aparılması tətbiq ediləcək preparatların dozalarının tənzimlənməsi və əks təsirlərinin azaldılması baxımından mühüm əhəmiyyət kəsb edir.

 

ƏDƏBİYYAT - ЛИТЕРАТУРА – REFERENCES:

 

1.  Tahir Yağdı çSanem Nalbantgil ,  Mustafa Özbaran .Kalp transplantasyonu: Ameliy yat öncesi degerlendirilme ,ameliyyat  sürecinde bakım ve sonrasında izleme//Türk Kardiyol Dern Arş., 2015, vol.43,  №1, p.95-108.

2. Bennett  W.M., DeMattos A., Meyer M.M., et al. Chronic cyclosporine nephropathy: the Achilles’ heel of immunosuppressive therapy//Kidney Int. 1996,vol.50,p.1089-1100.

3.   Carrel A., Guethrie C.C. The  transplantation of veins and organs// Am. Med., 2012, vol. 10, p.1101-1117.

4. De Denus  S., Zakrzewski M., Barhdadi A., et al.Association between renal function and CYP3A5 genotype in heart transplant recipients treated with calcineurin inhibitors// Heart Lung Transplant. 2011 , №3, p.326-331.

5.  De  Jonge H., Kuypers D.R. Pharmacogenetics in solid organ transplantation: current status and future directions// Transplant Rev (Orlando). 2008,  vol.22, №1, p.6-20.

6. Evans  W.E., McLeod H.L. Pharmacogenomicsdrug disposition, drug targets, and side effects// N Engl. J. Med. 2003, vol.348, p.538–569.

7. Haufroid V., Mourad M., Van Kerckhove V.The effect of CYP3A5 and MDR1 (ABC B1) polymorphisms on cyclosporine and tacrolimus dose requirements and trough blo od levels in stable renal transplant patients// Pharmacogenetics. 2004 ,vol.14, №3,p.147-154.

8. Herrero  M.J., Almenar L., Jordán C., Sánchez I., Poveda J.L., Aliño S.F. Clinical interest of pharmacogenetic polymorphisms in the immunosuppressive treatment after heart transplantation //Transplant Proc. 2010  ,vol.8,  №3, p.181-182.

9. Krüger B., Schröppel B., Murphy B.T. Genetic polymorphisms and the fate of the transplanted organ// Transplant Rev (Orlando). 2008 , №2 , p.131-140.

 10. McLeod H.L., Siva C. The thiopurine S-methyltransferase gene locus -implications for clinical pharmacogenomics// Pharmacogenomics.  2002, №3, p.89–98.

 11. Ojo A.O., Hanson J.A., Wolfe R.A., et al. Long-term survival in renal transplant recipients with graft function// Kidney Int. 2000, vol.57, p. 307–313.

12. Tsunoda  S.M., Aweeka F.T. The use of therapeutic drug monitoring to optimise immunosuppressive therapy// Clin Pharmacokinet. 1996, vol.30, p.107-112.

13. Zhou X., Barber W.H., Moore C.K,, et al. Frequency distribution of cytochrome P450 3A4 gene polymorphism in ethnic populations and in transplant recipients//Res Commun Mol. Pathol. Pharmacol. 2006, vol.119, №1-6, p.89-104.