XRONİKİ STOMATOGEN İNFEKSİYA FONUNDA PORPHYROMONAS GİNGIVALİS İLƏ XƏSTƏLƏRİN AĞIZ BOŞLUĞU GİGİYENASININ VƏZİYYƏTİNİN VƏ İMMUN CAVABIN GÖSTƏRİCİLƏRİNİN QİYMƏTLƏNDİRİLMƏSİ.

15-02-2017

Статистические данные последних десятилетий свидетельствуют о росте частоты встречаемости воспалительных заболеваний ротовой полости в большинстве стран мира [1, 2, 11, 12]. По данным ряда авторов, доля пульпита и периодонтита у людей в возрасте до 45 лет составляет 45-50% стоматологических заболеваний [12]. Установлено, что в период с 1990 до 2010 гг. число заболеваний полости рта увеличилось на 20,8%, причем, в основном, за счет пародонтоза и осложнений нелеченного кариеса [2, 11]. В связи с чем, вопросы профилактики и лечения кариеса и заболеваний пародонта не теряют своей актуальности [2, 12].

Ведущим источником хронического воспаления является пародонтопато-генная микрофлора, распространение которой может происходить с током крови. В настоящее время сформировалось представление о том, что бактериальный состав микрофлоры является одним из ведущих пусковых факторов развития воспалительных заболеваний пародонта [3, 4]. Микробиологические исследования показали, что воспалительные заболевания полости рта обусловлены воздействием преимущественно смешанных бактериальных и дрожжевых инфекций с более выраженной анаэробной составляющей. В ротовой полости выделено более 700 различных видов бактерий [3, 4, 13], в биопленках и мягком зубном налете, образующиеся на поверхности зубов и в зоне пародонтального кармана, - более 400 видов бактерий [4, 13]. К наиболее часто выявляемым в ротовой полости относятся микроаэрофильные (Actinobacillus actinomycetemcomitans, Campylobacter rectus, Eikenella corrodens) и анаэробные виды (Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, Eubacterium, Spirochetes) [3, 4, 13].

По современным литературным данным существует тесная взаимосвязь между состоянием биоценоза ротовой полости и иммунным профилем [3]. Бактерии, проникающие в ткани, дают старт каскаду иммунологических процессов, поражая клетки, выделяя токсины и продукты обмена веществ [3, 4]. Колонизация бактериальной микрофлоры в ротовой полости способствует нарушению защитных иммунных механизмов, поражению и деструкции тканей, а также активации и пролонгированию иммунодеструктивных процессов. Активация Tool-рецепторов эпителиальных клеток, лимфоцитов, нейтрофилов и макрофагов в тканях ротовой полости вызывает повышение синтеза провоспалительных цитокинов - интерлейкина-1β (ИЛ-1β), фактора некроза опухоли (ФНО-α), что в свою очередь способствует воспалению и инфильтрации иммунных клеток [5].

Следовательно, установление взаимосвязи между состоянием микрофлоры полости рта и провоспалительными цитокинами для изучения проблемы воспалительных заболеваний пародонта является актуальным.

Целью исследования явилась оценка индексов гигиенического состояния полости и показателей иммунного ответа у пациентов с наличием Porphyromonas gingivalis в микрофлоре ротовой полости на фоне хронической стоматогенной инфекции.

Материал и методы. Данное исследование проводилось на базе кафедры терапевтической стоматологии и кафедры микробиологии и иммунологии Азербайджанского Медицинского Университета. В исследование было включено 20 пациентов с хронической стоматогенной инфекцией с наличием Porphyromonas gingivalis в микрофлоре ротовой полости. Возраст пациентов колебался от 20 до 68 лет, средний возраст составил 42,25±12,02 лет. Мужчин было 4 (20,0%), женщин - 16 (80,0%). Критерием включения явилось наличие первичных очагов хронической стоматогенной инфекции, критериями исключения - наличие хронических очагов лор-органов, в основном, хронический тонзиллит, хронический фарингит.

Контрольную группу составили 25 практически здоровыx лица в возрасте от 22 до 61 лет, средний возраст - 36,7±9,81 лет, мужчины составили 48,0% (12), женщины - 52,0% (13).

Для идентификации вида бактерий содержимое пародонтального кармана, каналов и кариозных полостей извлекали с помощью стерильной турунды и в течение 30 мин доставляли в лабораторию. Для выделения анаэробной флоры производили посев, используя кровяной, сахарный, желточно-солевой агары. Посевы помещали в анаэростаты с пакетами Anaerocult A (Merck KGaA) Darmstadt, Germany). Изолированные колонии бактерий в аэробных условиях получали, используя кровяной агар, сахарный и желточно-солевой агары, среду Сабуро. Культивирование в аэробных условиях проводили до 3 суток, в анаэробных - до 10 суток.

О гигиеническом состоянии полости рта судили по упрощенному индексу гигиены OHI-S (Green J.C., Vermilion J.R., 1964), об интенсивности заболеваний тканей пародонта - по папилярно-маргинально-альвеолярному индексу - РМА (Раrmа С., 1960) и пародонтальному индексу - PI (Russel А., 1956).

Секреторный IgA (sIgA) в ротовой жидкости определяли твердофазным методом иммуноферментного анализа, основанным на принципе «сэндвича». Концентрацию sIgA в пробах определяли по калибровочному графику. Калибровочные пробы sIgA стандартизированы относительно препарата sIgA человека фирмы JCN (США). Использован набор «sIgA-ИФА-БЕСT-стрип» (Новосибирск, Россия).

Концентрации ИЛ-1β и фактора некроза опухоли (ФНО-α) в периферической крови определены методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью коммерческих наборов ProCon (ТОО "Протеиновый контур", Россия, Санкт-Петербург).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием методов оценки достоверности результатов, методов вариационной статистики по стандартным методикам. Обработка и анализ полученных данных выполняли на персональном компьютере с использованием прикладных программ Microsoft Office (Excel), пакета статистической программы «Statistiсa 7.0».

Результаты и обсуждение.Результаты исследования показали более частую встречаемость Porphyromonas gingivalis (Bacteroides gingivalis) в сочетании с одним из видов бактерий (рис.1).

Как видно из рис.1, Porphyromonas gingivalis наиболее часто встречался в сочетании с одним видом бактерий. В 15,% случаев это был Staphyl.aureus, в 10,0% случаев - Streptoc.haemol. и Fusobacterium spp, соответственно, и в 5,0% случаев соответсвенно Streptoc.mutans, Actinomyces spp и Enterococcus spp. У обследованных пациентов выявлялась ассоциация Porphyromonas gingivalis с Streptoc. mutans + Candida spp в 5,0% случаев, ассоциация Staphyl.aureus + Actinomyces spp (5,0%), Staphyl.aureus + E.coli (5,0%) и Staphyl.aureus + Enterococcus spp (5,0%), Fusobacterium spp + E.coli (5,0%). В 15,0% случаев определялось сочетание Porphyromonas gingivalis с тремя видами бактерий: Streptoc.haemol. + Fusobacterium spp + E.coli (5,0%), Streptoc.haemol. + Candida spp + Staphyl.aureus (5,0%) и Streptoc. mutans + Candida spp + Actinomyces spp (5,0%).

Рис.1. Частота встречае-мости Porphyromonas gingiva-lis моно и в ассоциации с другими видами бактерий у пациентов с хронической стоматогенной инфекцией

Следовательно, в ассоциациях Porphyromonas gingivalis доминировали виды семейства стрептококков и стафилококков.

Показатели индекса PI, отражающий тяжесть пораже-ния пародонта, и индекса гигиены ОНI-S изображены на рис.2.

Максимальная величина индекса гигиены ОНI-S отмечалась при ассоциации Porphyromonas gingivalis с одним из микроорганизмов (3,31±1,19 баллов, против 1,21±0,06 баллов в контрольной группе), максимальная величина PI (4,49±0,92 баллов) - при наличии лишь Porphyromonas gingivalis. Минимальный показатель ОНI-S и PI выявлен у пациентов с сочетанием Porphyromonas gingivalis с двумя видами бактерий. Наиболее высокое значение индекса РМА - папиллярно-маргинально-альвеолярного пародонтологического индекса, выражающего степень воспалительного процесса, определялось у пациентов с Porphyromonas gingivalis - 72,7±26,1%, что в среднем в 1,5 раза (р<0,05) было выше, чем в группе пациентов с ассоциацией Porphyromonas gingivalis с 1 и 3 видами бактерий соответственно и в 1,9 раза (р<0,05) выше, чем при сочетании Porphyromonas gingivalis с 2-мя видами бактерий.

  Рис.2. Индекс гигиены ОНI-S и PI (в баллах) у пациентов с Porphyromonas gingivalis моно и в сочетании с другими бактериями

Определение sIgA в ротовой жидкости показало существенное снижение его количества у пацентов всех групп (рис.3). При этом в среднем минимально низкая концентрация выявлена у пациентов с ассоциацией Porphyromonas gingivalis с тремя видами микроорганизмов, а максимально высокая - при сочетании Porphyromonas gingivalis с двумя видами бактерий.

Рис.3. Средние значения секреторного IgA (мкг/мл) в ротовой жидкости у пациентов с Porphyromonas gingivalis

Анализ показал, что у пациентов достоверной разницы в содержании sIgA в зависимости от сочетания Porphyromonas gingivalis с другими бактериями не отмечалось. Однако в сравнении с контрольной групп-пой наблюдалось статистически достоверное различие с лицами, у которых Porphyromonas gingivalis выявлялся как отдельно, так и в микробной ассоциации. Уровень sIgA в ротовой жидкости у пациентов только с Porphyromonas gingivalis был снижен в 1,5 раза (р<0,05), у пациентов с сочетанием Porphyromonas gingivalis с 1 и 3 видами - в 1,6 раза (р<0,05) соответственно, в смешаной миробной ассоциации с двумя видами - в 1,4 раза (р<0,05).

Таким образом, наиболее низкая концентрация sIgA в ротовой жидкости отмечалась у пациентов с сочетанием Porphyromonas gingivalis с тремя видами бактерий. 

Исследование количества провоспалительных цитокинов показало их значительное повышение у пациентов с наличием Porphyromonas gingivalis в микрофлоре ротовой полости относительно контрольных показателей (рис.4).

 Рис. 4. Средний уровень ИЛ-1β и ФНО-α в крови (пмг/мл) у пациентов с Porphyromonas gingivalis

Как следует из рис.4, максимально высокий уровень ИЛ-1β в крови выявлялся у пациентов с моно Porphyromonas gingivalis и статистически значимо превышал контрольный уровень в 2,8 раз (р<0,01), а максимально высокий уровень ФНО-α в крови отмечался у пациентов со смешанной микробной ассоциацией из 3-х видов бактерий и почти во столько же раз был выше контрольного (2,7 раз, р<0,01). Предельно низкое содержание ИЛ-1β и ФНО-α встречалось у пациентов при сочетании Porphyromonas gingivalis с 1 видом бактерий - 110,0±6,4 пмг/л и 114,6±6,8 пмг/л, что достоверно превышало контрольные величины в 2,5 раза (р<0,01) соответственно.

Таким образом, при изучении гигиенического состояния ротовой полости у пациентов, опираясь на полученные результаты, мы можем отметить статистически значимое увеличение индекса Грин-Вермильон в группе обследованных с Porphyromonas gingivalis, при этом лица с ассоциацией Porphyromonas gingivalis с одним видом бактерий отличались наиболее интенсивным зубным налетом и зубным камнем, а пациенты с наличием Porphyromonas gingivalis (моно) в микрофлоре ротовой полости стастически значимо отличались высокой степенью воспаления пародонта и десны, на что указывали высокие величины индексов PI и PMA. По данным литературы, микробиологические исследования показали, что воспалительные заболевания полости рта обусловлены воздействием в основном смешанных бактериальных инфекций с более выраженной анаэробной составляющей [4]. С действиями микроорганизмов непосредственно связаны иммунологические исследования. Однако, во многих случаях не представляется возможным объяснить разнообразие ответной реакции тканей пародонта на действие идентичных микроорганизмов или их ассоциаций [3, 5]. Иммунная система и ее эффекторы оказывают на тканевые структуры повреждающее действие, эффекты которого, в том числе разрушение зубодесневого соединения и периодонтальной связки, резорбция альвеолярной кости, становятся основой грубых функциональных нарушений [3]. Это сопровождается образованием очагов гранулематоза, деструкцией круговой связки и проникновением воспалительного инфильтрата вглубь с развитием и нарастанием резорбтивных изменений в альвеолярной кости [4].

Согласно полученным нами данным у пациентов с Porphyromonas gingivalis как моно, так и в смешанных ассоциациях были получены статистически значимые различия относительно уровня sIgA (p<0,05) в ротовой жидкости и ИЛ-1β и ФНО-α (p<0,01) в крови.

Porphyromonas gingivalis является основным патогеном пародонтита. Известно, что Porphyromonas gingivalis вызывает резорбцию альвеолярной кости и морфологические измерения - наиболее частые методы идентификации резорбции кости в периодонтальных исследованиях [6-8]. Porphyromonas gingivalis, этиологический агент при хроническом воспалительном заболевании пародонта, является заметным компонентом микробиома для полости рта и успешным колонизатором эпителия ротовой полости [9-10].

В последние десятилетия посредством биомедицинских исследований получены доказательства вклада микробиома в развитие целого ряда хронических заболеваний человека. Появляются новые свидетельства того, что Porphyromonas gingivalis, хорошо адаптированный оппортунистический патоген слизистой оболочки полости рта и видная составляющая оральных биопленок, наиболее известная своим участием в периодонтитах. Для профилактики и улучшения прогноза важно хорошее понимание патофизиологических механизмов и взаимодействия между Porphyromonas gingivalis и хозяином. Porphyromonas gingivalis - грамотрицательный анаэроб может существовать внутри эпителия хозяина без существования явной болезни, является высоко адаптированным возбудителем перорального микробиома [6,9,13].

В настоящее время предметом интенсивных исследований являются взаимосвязи между Porphyromonas gingivalis и другими патогенами полости рта. Недавние достижения в понимании патомеханизмов Porphyromonas gingivalis могут привести к разработке новых стратегий для ликвидации Porphyromonas gingivalis и лечения периодонтальных заболеваний в будущем.

Выводы. У пациентов с хронической стоматогенной инфекцией наличие в микрофлоре Porphyromonas gingivalis сопровождается высоким индексом Грин-Вермильон и высокой степенью воспаления пародонта и десны. Пациенты с ассоциацией Porphyromonas gingivalis с одним видом бактерий отличаются более интенсивным зубным налетом и зубным камнем. У пациентов с Porphyromonas gingivalis как моно, так и в смешанных ассоциациях отмечается статистически значимое снижение уровня sIgA (p<0,05) в ротовой жидкости и высокое содержание ИЛ-1β и ФНО-α (p<0,01) в крови.

 

ƏDƏBİYYAT - ЛИТЕРАТУРА– REFERENCES:

 

1.Алиева Р.К. Отработка оптимальной модели развития стоматологической службы детскому населению Азербайджанской Республики: Автореф. дис. … докт. мед. наук. Москва, 2001, 43 с.
2.Волошина А.А. Значение микробного фактора в развитии и течении воспалительных заболеваний пародонта // Молодой ученый, 2011, №1, с. 248-251.
3.Мамонтова Т.В., Веснина Л.Э., Кайдашев И.П. Микрофлора ротовой полости как фактор развития заболеваний сердечно-сосудистой системы // Укр. Мед. Часопис, 2014, 3 липня (электронная версия), с.1-8, www.umj.com.ua
4.Самигуллина Л.И., Таминдарова Р.Р. Влияние мелоксикама на содержание провоспалительных цитокинов ИЛ-1β и ФНО-α в ротовой жидкости пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения // Фундаментальные исследования, 2015, №1-2, с. 356-360.
5.Пашаев А.Ч. Эпидемиология кариеса у населения Азербайджана // Институт стоматологии, 2009, №2 (43), с. 16-17.
6.Baek K.J., Ji.S., Kim Y.C., Choi Y. Association of the invasion ability of Porphyromonas gingivalis with the severity of periodontitis // Virulence, 2015, vol.6, p.274–281.
7.Bostanci N., Belibasakis G.N. Porphyromonas gingivalis: an invasive and evasive opportunistic oral pathogen // FEMS Microbiol,2012, Lett, vol.333, p.1-9.
8.Casarin R.C.V., Del Peloso Ribeiro É., Mariano F.S., et al. Levels of Aggregatibacter actinomycetemco-mitans, Porphyromonas gingivalis, inflammatory cytokines and species-specific immunoglobulin G in generalized aggressive and chronic periodontitis // J. Periodont. Res, 2010, vol. 45, p.635-642.
9.Eloe-Fadrosh E.A., Rasko D.A. The human microbiome: from symbiosis to pathogenesis // Annu. Rev. Med., 2013, vol.64, p.145-163
10.Kassebaum N.J., Bernabé E., Dahiya M., et al. Global burden of severe periodontitis in 1990-2010: a systematic review and meta-regression. // J Dent Res., 2014, vol.93, No11, p.1045-1053.
11.Tolias D., Koletsi K., Mamai-Homata E. et al. Apical periodontitis in association with the quality of root fillings and coronal restorations: a 14-year investigation in young Greek adults // Oral Health Prevent. Dent., 2012, vol. 10, No3, p. 297-303.
12.Zenobia C., Hajishengallis G. Porphyromonas gingivalis virulence factors involved in subversion of leukocytes and microbial dysbiosis // Virulence, 2015, vol.6, p.236–24313.
13.Zenobia C., Hajishengallis G. Porphyromonas gingivalis virulence factors involved in subversion of leukocytes and microbial dysbiosis // Virulence, 2015, vol.6, p.236–243