“DETRALEKS” PREPARATININ YÜKSƏK EFFEKTİVLİ MAYE XROMATOQRAFİYA ÜSULU İLƏ ANALİZİ

21-06-2018

Açar sözlər: “Detraleks” preparatı, hesperidin, diosmin, YEMX-MS/MS.

“Detraleks” preparatı (Dövlət qeydiyyat nömrəsi:№13-00074) “Les Laboratoires Servier Industrie, (Fransa)” zavodunda istehsal edilir, tibb təcrübəsində venotonik və angioprotektor təsirə malik olduğuna görə xroniki venoz çatışmazlığında, venoz ayaq xoraları, venaların varikoz genişlənmələrində, tromboflebitlərdə və həmçinin də hemorroid patologiyası kimi ciddi xəstəliklərdə geniş istifadə edilir.“Detraleks” preparatının tərkibində olan əsas təsiredici komponentlər hesperidin və diosmindir.

Çoxkomponentli tərkibə malik bitki mənşəli preparatlarda ayrı-ayrı komponentlərin miqdarı təyini üçün yüksək effektivli maye xromatoqrafiyası üsulu müstəsna əhəmiyyət kəsb edir [1].

Müxtəlif dərman preparatlarında diosminin sürətli, bilavasitə analizi üçün Furye transformasiyalı infraqırmızı (FTIR) spektroskopik üsul işlənilib hazırlanmışdır. Məlumat emalında Buger-Lambert qanunu, 2 xemometrik yanaşma, bölünmüş ən kiçik kvadratlar (PLS) və əsas komponent reqressiya (PCR+) üsulları yoxla-nılmışdır [2].

Dozalanmış tabletlərdə diosmin və hesperidinin eyni vaxtda təyini üçün sadə, sürətli, dəqiq, yüksək dərəcədə seçici spektrofotometrik üsul işlənilib hazırlanmışdır. Bu üsul hesperidin və diosminin 285 (hesperidinin 

Diosminin təyini üçün yeni kolorimetrik üsul təklif edilmişdir. Bu üsul 75% (v/v) HCl-in iştirakında 405 nm-də maksimal udma göstərən flavonoidlərdən xromoforun formalaşmasına əsaslanır. Bu üsulda Daflon tabletlərində diosminə ekvivalent flavonoidlərin, Daflonun tərkibindəki diosminin və portağal qabığındakı flavonoidlərin təyini texnologiyası müqayisə edilmişdir [4].

Sitrus meyvələrinin (portağal, qırmızı və sarı qreypfrut, pomelo və sarı qreypfrutun hibridi) dimetilsulfoksiddə ekstraktlarındakı naringin və hesperidin 2 %-li sulu asetat turşusu və asetonitrildən hazırlanmış mobil faza ilə YEMX üsulu ilə analiz edilmişdir. Deteksiya 285 nm dalğa uzunluğunda aparılmışdır [5].

Citrus latifolia şirəsində diosmin, hesperidin və eriositrinin eyni vaxtda təyini üçün bərk fazalı ekstraksiya (SPE) və YEMX tətbiq edilmişdir. Bərk fazalı ekstraksiya üçün poliamiddən istifadə edilmiş, 0,8 mL/dəq axın sürəti olan mobil faza üçün su/asetonitril/asetat turşusu (78:19:3, v/v) götürülmüş və 280 nm-də UV detektorla təyinat aparılmışdır. SPE üçün optimal şərtlərə yuyucu məhlul kimi 8 mL su/methanol (85:15), elyuasiya üçün isə 4 mL metanol istifadə etməklə nail olunur [6].

Diosmin və hesperidinin dərman preparatlarında eyni vaxtda təyini üçün sürətli, sadə, dəqiq və iqtisadi cəhətdən səmərəli əks fazalı YEMX üsulu hazırlanmış və validasiya aparılmışdır. Flavonoidlərin və daxili standart metilparabenin effektiv şəkildə ayrılmasına hissəciklərinin ölçüsü 2.7 μm, temperaturu 50 olan ərimiş əsaslı Ascentis Express RP-Amide (100 × 3.0 mm) sütununda, axın sürəti 1ml/dəq olan mobil faza kimi asetonitril/ asetat turşusu ilə pH 3-ə qədər turşulaşdırılmış su (30:70, v/v) qarışığı ilə nail olunur  [8].

Tərkibində diosmin olan bir sıra dərman substansiyalarında və məhsullarında yeni təkmilləşmiş qradient  əks fazalı YEMX ilə UV detektoru istifadə edilərək 6 yaxın substansiya aşkar edilmişdir. Xromatoqrafik sistem Intersil Wondasil TM ODS (C 18) sütunundan (250 9 4.6 mm; 5 μm) ibarətdir. Axın sürəti 0,8 ml/dəq olan və qradient üsulu tətbiq edilən  mobil faza su/asetat turşusu 66:6 v/v (həlledici A) və metanoldan (həlledici B) ibarətdir. İnyeksiya həcmi 20 mkl götürülərək 345 nm-də təyinat aparılır [9].

Son illər aparılan tədqiqatlar bu preparatların eyni zamanda neyropatik ağrı modelində  hesperidinin tək və diosminlə kombinə olmuş formada mümkün sinergist və antinosiseptiv fəallığını təsdiq etmək üçün araşdırma aparılmış və onların antihiperalgezik təsirə malik olduğu [10] və qan serumuna bağlanmış diosminin oksidativ zədələnmələrdən meydana gələn deqradasiya  əleyhinə təsir göstərdiyi məlum olmuşdur [11]. 

İşin məqsədi“Detraleks” preparatında hesperidinin və diosminin YEMX-MS/MS ilə miqdarı təyinidir .

Material və metodlar:

Reagent və məhlullar.

-Hesperidin standartı (KRKA, seriya nömrəsi: 520-26-3);

-Diosmin standartı (World Medicine , seriya nömrəsi: WMRS899);

-Həlledici: dimetilsulfoksid (Вектон ОКП 932382);

-Hərəkətli faza: Asetonitril, HPLC Grade (Merck/Millipore, seriya nömrəsi: I762430 450), Buzlu sirkə turşusu, HPLC Grade (Merk/Millipore, seriya nömrəsi: K46218763448), Metanol, HPLC Grade (Merk/, seriya nömrəsi: I745808 431), Deionizə olunmuş su.

Avadanlıq. 1. Eksperimental tədqiqatlar LC/MC/MC-Agilent-12620 İnfinity (ABŞ) xromatoqrafında aparılmışdır. Hərəkətsiz faza “Zorbax SB-C18” (4.6 x 100 mm) borusu, hissəciklərin ölçüsü 3.5mkm. Borunun temperaturu 40⁰C, həlledicinin verilmə sürəti 1,5ml/dəqiqə, inyeksiya həcmi 10 mkl-dir. Xromatoqrammanın çəkilmə müddəti 20 dəqiqədir.

2.Vortex Mixer (DR.LAB: MX-S, Çin)

3.Table Top Centrifuge  (Çin)

4.Magnetic stirrer –HJ-3 (Çin)

Məhlulların hazırlanması.

Hərəkətli fazanın hazırlanması. Hərəkətli faza təmizlənmiş su, metanol, buzlu sirkə turşusu və asetonitrilin 66:28:6:2 nisbətinə uyğun hazırlanır və ultrasəsli su hamamı ilə deqazasiya olunur.

Tədqiq edilən məhlulu hazırlamaq üçün 0.4388 qr narın əzilib, poroşok halına salınmış “Detraleks” tableti götürüb,50 ml-lik həcmə malik ölçülü kolbaya yerləşdirilir, üzərinə 30 ml həlledici əlavə edilərək çalxalanır, sonra həcmi həlledici ilə ölçüyə çatdırılır və 45 dəq. ərzində maqnit qarışdırıcısı ilə 50-70°С-də qızdırılır. Alınmış məhlul 10000 dövr/dəq sürətlə 10dəq.  sentrifuqadan keçirilir.

Hesperidinin standart nümunəsinin məhlulunu hazırlamaq üçün 0.032 q hesperidin (dəqiq çəki) 50 ml-lik həcmə malik ölçülü kolbaya yerləşdirilir, üzərinə 30 ml həlledici əlavə edilərək çalxalanır, sonra məhlulun həcmi həlledici ilə ölçüyə çatdırılır və 45 dəq. ərzində maqnit qarışdırıcısı ilə 50-70°С-də qızdırılır.

Diosminin standart nümunəsinin məhlulunu hazırlamaq üçün 0.288q diosmin (dəqiq çəki) 50 ml-lik həcmə malik ölçülü kolbaya yerləşdirilir, üzərinə 30 ml həlledici əlavə edilərək çalxalanır, sonra məhlulun həcmi həlledici ilə ölçüyə çatdırılır və 45 dəq. ərzində maqnit qarışdırıcısı ilə 50-70°С-də qızdırılır.

Nəticələr və müzakirə. 

Metodikanın gedişatı:

“Detraleks” tabletində hesperidin və diosminin miqdari təyini üsulunun optimal şəraitini seçmək üçün inyeksiya həcmi, temperatur, axın sürəti və borunun müxtəlif göstəriciləri üzrə araşdırmalar aparılmışdır.

Miqdari təyinat üçün inyeksiya həcminin optimal şəraitinin seçilməsi məqsədilə müxtəlif həcmlər götürülmüşdür: 10 mkl, 12 mkl, 14 mkl, 16 mkl, 20 mkl və optimal zirvə sahəsinin alınması 10 mkl-də müşahidə edilməsinə görə optimal hesab edilir.

Temperaturun optimal şəraitini tapmaq üçün müxtəlif  dərəcələrdə sınaqlar həyata keçirilir: 30°C, 32°C, 36°C, 38°C, 40°C və optimal zirvə sahəsinin alınması 40°C-də müşahidə edilməsinə görə həmin temperatur optimal hesab edilir.

Axın sürətinin  optimal şəraitinin seçilməsi məqsədilə müxtəlif sürətlər götürülmüşdür: 0.8 ml/dəq, 1.0 ml/dəq, 1.2 ml/dəq, 1.5 ml/dəq və optimal zirvə sahəsinin alınması  1.5 ml/dəq -də müşahidə edilmişdir.

 Tədqiqatlar nəticəsində inyeksiya həcminin 10 mkl, temperaturun 40°C, axın sürətinin 1.5 ml/dəq və “Zorbax SB-C18” (4.6 x 100mm) borusunun optimal olduğu müəyyən edilmişdir.

Tədqiq edilən məhlulu hazırlamaq üçün 0.4388 qr narın əzilib, poroşok halına salınmış “Detraleks” tableti götürüb, 50 ml-lik həcmə malik ölçülü kolbaya yerləşdirilir, üzərinə 30 ml həlledici əlavə edilərək çalxalanmaqla həll edilir, sonra həcmi həlledici ilə ölçüyə çatdırılır və 45 dəq. ərzində maqnit qarışdırıcısı ilə 50-70°С-də qızdırılır. Nəticədə 0.64 mq/ml və 5.76 mq/ml  qatılıqlı məhlul alınır. Alınmış məhlul 10000 dövr/dəq sürətlə 10dəq. müddətində sentrifuqadan keçirilir. Alınmış məhlul məsamələrinin ölçüsü 0,45 mkm olan ftoroplast filtrdən süzülür.

Hesperidinin standart nümunəsinin məhlulunu hazırlamaq üçün 0.032 q hesperidin (dəqiq çəki) 50 ml-lik həcmə malik ölçülü kolbaya yerləşdirilir, üzərinə 30 ml həlledici əlavə edilərək çalxalanır, sonra məhlulun həcmi həlledici ilə ölçüyə çatdırılır və 45 dəq. ərzində maqnit qarışdırıcısı ilə 50-70°С-də qızdırılır. Nəticədə 0.64 mq/ml qatılıqlı məhlul alınır.

Diosminin standart nümunəsinin məhlulunu hazırlamaq üçün 0.288q diosmin (dəqiq çəki) 50 ml-lik həcmə malik ölçülü kolbaya yerləşdirilir, üzərinə 30 ml həlledici əlavə edilərək çalxalanır, sonra məhlulun həcmi həlledici ilə ölçüyə çatdırılır və 45 dəq. ərzində maqnit qarışdırıcısı ilə 50-70°С-də qızdırılır. Nəticədə 5.76 mq/ml qatılıqlı məhlul alınır.

Tədqiq edilən məhlul, eləcə də hesperidin və diosminin standart nümunə məhlulları YEMX-da xromatoqrafiya edilərək hər birindən 5 xromatoqram alınmışdır. Alınan nəticələr 1saylı şəkildə göstərilmişdir.

                                                                          

                    I                                                       II                                                       III

Şəkil 1. “Detraleks” preparatı (I), diosmin (II) və hesperidinin  (III) standart nümunəsinin xromatoqramları

Preparatda hesperidin və diosminin miqdarı (X) aşağıdakı formula əsasən hesablanır.

burada:

S -  nümunənin zirvə sahəsinin  göstəricisi, nisbi vahidlə;

S₀ - standartın zirvə sahəsinin göstəricisi,nisbi vahidlə;

m_s – standartın çəkisi, q - la

m_n – nümunənin çəkisi, q - la

Cədvəl  № 1.

“Detraleks” preparatının miqdari təyini üzrə statistik nəticələr

Detraleksin miqdarı (q)	Götürülən poroşokda təsiredici maddənin miqdarı (q)	Müəyyən olunan miqdar			Меtroloji xarakteristika
		(q)	%
0.4388 q	0.32 q (0.032 hesperidin+0.288 diosmin)	0.3213		100.4
		0.3178		99.3	S=0.178
		0.3197		99.9
		0.3155		98.6
		0.3203		100.1	A=±0.19%
		0.3181		99.4	a=|99.41%-99.79%|

Analiz nəticələrinin statistik işlənilməsi Stüdentin t_α - meyarı ilə,  korrelyasiya əmsalı isə Pirson üsulu ilə aparılmışdır. Alınan nəticələr 1 saylı cədvəldə verilmişdir.

1saylı cədvəldən göründüyü kimi “Detraleks” preparatında YEMX-MS/MS ilə miqdari təyinat üsulunun  statistik hesablamaların göstəriciləri müvafiq tələblərə uyğundur.

Nəticə

Tərkibində diosmin və hesperidin olan “Detraleks” preparatının  YEMX-MS/MS üsulu ilə eynilik və miqdari təyini aparılmışdır.

“Detraleks”preparatında diosminin zirvə sahəsi 4985497.32, hesperidinin zirvə sahəsi isə 3901517.18 olmuşdur. “Detraleks” preparatının miqdari təyini üçün təkmilləşdirilmiş YEMX-MS/MS üsulu işlənilib hazırlanmış və optimal analiz şəraiti seçilmişdir. Təklif edilən üsul preparatın keyfiyyətinə nəzarət məqsədilə istifadə oluna bilər.

 

ƏDƏBİYYAT- ЛИТЕРАТУРА– REFERENCES:

 

1.Süleymanov T.A., Balayeva E.Z. Kalinol plus şərbətində timolun YEMX ilə  miqdari təyinat üsulunun validasiyasına aid bəzi göstəricilər // Azərbaycan Əczaçılıq və Farmakoterapiya Jurnalı, 2015, N2 , səh. 11-16.
2.Andrei A., Gabriela E., Lavinia L. et all. Determination of diosmin in pharmaceutical formulations using Fourier transform infrared spectrophotometry  //  Saudi Pharmaceutical Journal, 2009, vol.17, p. 303– 306.
3.Doddi.S, Mahesh N., Borra N. et all. Development and Validation of UV Spectrophotometric Method for Simultaneous Estimation of Hesperidin and Diosmin in the Pharmaceutical Dosage Form  //  Hindawi Publishing Corporation, vol. 2013, p. 1-4.
4.Mir S., Ahangar A., Bhat A. Simple Colorimetric Method For Assaying Diosmin And Flavonoids In Daflon Tablets And Orange Peel Extracts  //  International Journal of PharmTech Research, 2013, vol.5, p. 341-348.
5.Gorinstein S., Huang D., Leontowicz H. et all. Determination of naringin and hesperidin in citrus fruit by high performance liquid chromatography. The antioxidant potential of citrus fruit  //  acta chromatographica, 2006, vol.17, p. 108-124.
6.Saeidi I., Hadjmohammadi M., Peyrovi M. et all. HPLC determination of hesperidin, diosmin and eriocitrin in Iranian lime juice using polyamide as an adsorbent for solid phase extraction  //   Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 2011, vol. 2, p. 419-422.
7.Garima M., Vikas K., Abhinav T. Analytical method development and validation for assay of  Diosmin and Hesperidin in combined tablet dosage form by RP- HPLC  //  İnternational journal of pharmacy & life sciences, 2013, vol. 4, p. 2834-2839.
8.Dalibor S., Katerina J., Lucie H., Petr S. New and Fast HPLC Method for Determination of Rutin, Troxerutin, Diosmin and Hesperidin in Food Supplements Using Fused-Core Column Technology  //  Food Analytical Methods, 2013, vol. 6, p. 1353–1360.
9.Imene A., Mingluo D. Identification and Determination of Related Substances in Diosmin Bulk Drug and Pharmaceutical Formulations by HPLC and HPLC–MS  //  Chromatographia, 2013, vol. 76, p. 499–508.
10.Azucena I., Carballo-Villalobos, María-Eva G. et all. Antihyperalgesic Effect of Hesperidin Improves with Diosmin in Experimental Neuropathic Pain  //  BioMed Research International, vol. 2016, p. 1-12.
11.Davide B., Giuseppina L., Giuseppe B. et all. Diosmin binding to human serum albumin and its preventive action against degradation due to oxidative injuries  // Biomed, 2013, vol. 95, p. 2042-2049.