EKSPERİMENTDƏ ŞƏKƏRLİ DİABETİN MODELLƏŞDİRİLMƏSİ ÜSULLARI

26-04-2018

Açar sözlər: şəkərli diabet, eksperimental modelləşmə, streptozotosin, alloksan.

Keywords:diabetes, experimental model, streptozotocin, alloxane.

Eksperimental olaraq şəkərli diabetin (ŞD) hər 2 tipinin spontan inkişaf etməsini təmin edən bir sıra üsullar mövcuddur [1,2]. Həmçinin ŞD-nın cərrahi yolla [3] və mədəaltı vəzin β-hüceyrələrindən insulin sekresiyasını destruksiya edən farmakoloji preparatlarla eksperimental olaraq modelləşdirilməsi mümkündür [4], eləcə də “nokaut” texnologiyası və spesefik genlərin transgen hiperekspressiyası kimi gen mühəndisliyi metodları, eləcə də iltihab prosesi fonunda xüsusi dietik qida rasionu [5, 6] ilə ŞD-nın modelləşdirilməsi elmə məlumdur. Eksperimental olaraq ŞD-nın modelləşdirilməsinin çox saylı metodların olmasına baxmayaraq, streptozotosinin diabetogen sitotoksinilə (STZ) yaradılan diabet modeli çox geniş yayılmışdır [7]. STZ-nin pankreotoksik təsiri müvafiq hüceyrə DNT-sinin metil qrupunu alkilləşdirərək fraqmentasiyasını törədir. Bu da zədələnmiş DNT-nin reparasiyasında iştirak edən ADF-riboza fermenti aktivləşməsi ilə izah edilir. Müvafiq fonda NAD+ kofaktor ehtiyatının və nəticə etibarı ilə energetik substrat olan ATF-in tükənməsi baş verir ki, bu da yekunda β-hüceyrələrinin nekrozuna gətirib çıxarır [8, 9]. STZ-nin diabetogen effekti bir çox canlılarda, o cümlədən siçovullarda, itlərdə, pişiklərədə, meymunlarda, dəniz donuzlarında və s. müşahidə edilir ki, ən maksimal sensibilizasiya siçovullarda qeydə alınmışdır. Bununla yanaşı, STZ-nin optimal diabetogen dozası heyvanın bədən kütləsi artmasına mütanasib olaraq azalır [10]. STZ paraşoku -20° С tempraturda, plastik flakonlarda və işıq düşməyən yerdə saxlanılmalıdır. Müvafiq paroşokun həlledicisi 4,5. pH-a malik Na sitrat buferidir. Na sitrat buferinin hazırlanması bir neçə mərhələdən ibarətdir:1) 47 ml 0,1 M limon turşusunun məhlulu (tərkibinə 21,01 q/l monohidrat limon turşusu daxildir) və 53 ml 0,1 M limon turşusunun trinatrium duzu (tərkibinə 29,41q/l dihidrat trinatrium duzu daxildir) qarışdırılır; 2) Alınmış tərkibi distillə edilmiş su qatmaqla 950-970 ml-ə qədər çatdırılır; 3) Məhlulun həcmi PH-ı ölçülməklə 1000 ml-ə qədər çatdırılır; 4) Əgər pH 4,5-dən yüksəkdirsə bir neçə damcı 0,1 M limon turşusu, pH 4,5-dən aşağıdırsa bir neçə damcı Na sitratın sulu məhlulu əlavə edilir [11]. Qeyd etmək vacibdir ki, təzə hazırlanmış məhluludan və ya -20° С-də dondurulduqdan sonra donu açılmış qarışıqdan istifadə məsləhət görülür. STZ poroşoku işıq keçirməyən şüşə qabda həll edilməli və heyvanlara venadaxili və ya qarınboşluğuna yeridilməlidir. Sitotoksinin yeridilmə yolları (qarınboşluğu və venadaxili) və dozasından asılı olaraq eksprimentdə yüngül, prediabetik və tamailə insulin çatışmazlığı kimi müxtəlif karbohidrat mübadiləsi pozulması modelini yaratmaq mümkündür [12]. Şəkərli diabet 1 tipinin (ŞD1) modelləşdirilməsi məqsədilə 8-10 həfətlik, bədən kütləsi 200-250 qr olan siçovullara STZ-nin sitrat buferində həll edilmiş 55-60 mq/kq dozada məhlulu venadaxili olaraq yeridilir İntraperitonal yeridilmə yolu yüksək dozalar tələb edir və qidalanmadan 12-16 saat sonra, yəni ac halda yeridilir. Belə ki, qidalanma STZ-nin diabetogen effekti azaldır, yəni qlikemiyanın posprandal artırılması fonunda heyvanların STZ-yə həssaslığı azalır. STZ inyeksiyasından 4-8 saat sonra qabarıq təzahür edən hipoqlikemiya vəziyyətində, eksperimental heyvanlar preoral 5%-li qlükoza məhlulu alırlar. Müvafiq fonda ŞD STZ inyeksiyasından 48 saat sonra qanda şəkərin səviyyəsi 15 mmol/l təşkil etdiyi zaman təsdiqlənir. ŞD-nın laborator olaraq modelləşdirilməsi eksperimenti nəzərəçarpacaq hiperqlikemiya (30 mmol/l-dan çox) və insulinopeniya fonunda dayandırılır [13]. STZ vasitəsilə diabetin neonatal modelləşdirilməsi 2 yolla aparılır: 1) antenatal dövrün II sutkasında bir dəfə inyeksiya etmək şərtilə, hər bədən kütləsinə 100 mq/kq dozada qarın boşluğuna yeridilir; 2) 5 günlük siçovul balalarına 80 mq/kq dozada STZ qarınboşluğuna yeridilir. Kontrol qrupu heyvanlarına isə analoji miqdarda sitatlı bufer yeridilir. Antenatal dövrün 28-ci günü siçovul balaları anadan ayrılır. Qeyd etmək vacibdir ki, ŞD-nın modelləşdirilməsinin II variantında 3 gün ərzində heyvanlarda yüksək letallıq (50%) müşahidə edilir. Eksperimental modelin I variantında, 2 günlük siçovul balalarına STZ-nin yeritdikdən 3-5 gün sonra kəskin insulin difesitli diabet (nəzərəçarpacaq hiperqlikemiya, insulinemiya, qan plazmasında qlikoqon səviyyəsinin yüksəlməsi) inkişaf edir. Edilən inyeksiyanın heyvanlara göstərdiyi letallıq 30 % təşkil edir. Siçovulların 8-ci həftəsindən başlayaraq yüngül bazal hiperqlikemiya, qlükozaya tolerantlıq, mədəaltı vəzdə qlükoqon səviyyəsi dəyişmədən insulin miqdarının 50%-ə qədər azalması baş verir. STZ-nın 5 günlük siçovul balalarına yeridilməsi fonunda (II variant) diabetin daha kəskin forması inkişaf edir. ŞD 2 tipinin diaqnostikası STZ inyeksiyasından 1 həftə sonra aparılır. Bu məqsədlə heyvanlara ac qarnına qlükozanaın 40%-li məhlulunu 3 q/kq dozada intraqastral yolla yeritdikdən 30, 60, 90 və 120 dəqiqə sonra qanda qlükozanın səviyyəsi müəyyən edilir. Həmçinin qlikemiyanın qanda səviyyəsi 9,0 -14,0 mmol/l təşkil etməsi şərtilə aparılır. Digər tədqiqatların nəticələri göstərir ki, nikotinamidinn 230 mq/kq dozası STZ inyeksiyasından (65 mq/kq) 15 dəq əvvəl yeridilməsi sitotoksinin β-hüceyrələrə zədələyici təsirini azaldaraq, hissəvi insulinopeniya törədir [14] STZ-nin yüksək dozada birdəfəlik yeridilməsi siçovullarda nəzərəçarpacaq insuliopeniyaya və xəstəlik dövründə sürətli dekompensasiyaya gətirib çıxarır ki, bu da uzunmüddətli xroniki eksperimentin aparılmasına çətinlik törədir. Müvafiq vəziyyət, xüsusilə də antidiabetik preparatların tədqiqini məhdudlaşdırır. Qeyd etmək vacibdir ki, yağlarla zəngin qida ilə qidalandırılan və ikiqat STZ inyeksiya edilən heyvanlarda, orta hiperqlikemiya vəziyyətinə baxmayaraq SD 1 tipi ilə müqayisədə morfoloji diabetik dəyişikliklər daha dərin təzahür edir [15]. Qeyd edilən qüsurlara və ŞD-nın eksperimental heyvanlarda modelləşdirilməsinin çox saylı üsullarının mövcud olmasına baxmayaraq, ŞD-nın streptozotosin modeli bu gün də ən əlverişli və reallaşması nisbətən rahat üsul olmaqdadır. Digər tərəfdən siçovullarda alimentar piylənmə fonunda STZ yeritməklə mülayim hiperqlikemiya, insulinə rezistentlik, dislipidemiya və ŞD 2 tipinin əsas patogenetik modelini yaratmaq mümkündür [16]. Eksperimental olaraq ŞD2 tipi modelinin yaradılmasının bir neçə üsulu mövcuddur: siçovullarda genetik faktora əsaslanan Zucker Diabetic Fatty (ZDF) və Goto-Kakizaki (GK) üsulu [17]. ŞD-1 tipinin modelləşdirilməsi STZ-nin 50 mq/kq-dan yüksək dozası fonunda aparılır ki, bu da β-hüceyrələrdən insulin ifrazının kəskin azalmasına səbəb olur. Müvafiq modelin patogenez və klinik simptomları tipik ŞD-2 tipindən fərqlənir. ŞD-2 tipi lipid mübadiləsi pozulması və insulinə periferik rezistentlik vəziyyətində hiperqlikemiyanın inkişaf etməsilə şərtlənir [18]. Bununla yanaşı, STZ-nın kiçik dozaları ŞD2 tipinin sonrakı mərhələlərində olduğu kimi insulin sekresiyasında yüngül dəyişiklik törədir. Bu səbəbdən, bütün dünyada yüksək yağlı dieta və STZ-nın kiçik dozalarının kombinə etməklə ŞD2 tipi modeli yaradılır ki, bu da insanda müvafiq xəstəliyin patogenezinə uyğundur [19]. Спасов А.А və həmmüəllifləri ŞD-2 tipinin modelləşdiriləsi məqsədilə aşağıdakı üsullardan istifadə etmişlər. Bu məqsədlə Wistar cinsli siçovullar üzərində aparılır. Heyvanlar 25 ⁰ C tempraturda, standart işıqlanma şəraitində saxlanılır. Eksperimentdən qabaq heyvanlar limitsiz su və kombi-qida (kombinəedilmiş qida) ilə təmin edilir. Təcrübə siçovullarında piylənməni təmin etmək məqsədilə yüksək yağlı dieta (YYD) təyin edilir. YYD kombi-qida (13000 Kc/kq-19% zülal, 5% yağ, 4% sellüloz, 1,2% lizin, 0,7% metionin+sistein, 0,6-0,9% kalsium, 0,6-0,9% fosfor, 0,2-0,25% natrium), donuz piyi, kazein, metionin və vitamin-mineral tərkibli qarışıq-premiksdən ibarətdir. 1 kq premiksin tərkibinə vit. A-1000000 МЕ, vit. D3 — 300000 МЕ, vit. Е — 1,0 qr, vit. В2 —0,6 qr, vit. В12 — 12 mq, Fe-20 qr, mis-4 qr, Mg-6 qr, Zn-10 qr, Co-0,08 qr, yod-0,4 qr daxildir. Daha sonra kombi-qida - 370 qr/mq, donuz piyi - 313 qr/kq, kazein - 253 qr/kq, vitamin-mineral kompleksi - 61 qr/kq, metionin - 3 qr/kq nisbətində eynicinsli kütlə alınana kimi xırdalanır və qarışdırılaraq +4 °С tempraturda saxlanılır. Müvafiq qarışımın 1 heyvan üçün sutkalıq dozası 30 qr təşkil edir. YYD məqsədilə heyvanlar hər qrupda 10-12 ədəd olmaqla qruplaşdırılır. Eksperimentə cəlb edilən heyvanlara YYD ilə yanaşı su ilə təmin edilməlidir. 1 həftə sonra heyvanların bədən kütləsi və qandakı qlükoza səviyyəsi qeydə alınır. Eksperimentin II həftəsindən sonra təcrübə heyvanlarının qarın boşluğuna 35 mq/kq streptozotosinin sitrat buferi və nəzarət qrupu heyvanlarına isə 1 ml/kq dozada sitrat buferi yeridilir. Eksperiment qoyulduqdan 3 həftə sonra heyvanların bədən kütləsi və qan plazmasındakı qlükoza qatılığı təkrar qeydə alınır. İnsulinə və qlükozaya tolerantlıq intraperitonal test vasitəsilə aparılır. Bu məqsədlə YYD təyin edilmiş 4 təcrübə və nəzarət heyvanı götürülür. Eksperimentə başlamadan 3 saat əvvəl, sudan azad istifadə şərtilə heyvanlar qidadan məhrum edilir. Bütün heyvanlara NaCl –in izotonik məhlulunda 1 mq/kq qlükoza və 0,175 ME/kq insulin intraperitonal yeridilir. İnyeksiya edildikdən 5-ci, 10-cu, 15-ci və 30-cu dəqiqə sonra təhlil üçün qan götürülür. Qan heyvanların quyruq venasından 20 mkl həcmdə götürülür. Müəlliflərin ŞD-nın modelləşdirilməsi məqsədilə apardıqları tədqiqatların nəticələri göstərir ki, Wistar cinsli siçovullara təyin edilən yüksək yağlı dieta və 35 mq/kq dozada STZ-nın qarınboşluğuna yeridilməsi nəzərəçarpacaq hiperqlikemiya, eləcə də insulinə tolerantlıq halının inkişaf etməsinə gətirib çıxarır [20]. Srinivasan К. et al. (2005) ŞD –nın eksperimental modelinin belə bir variantını hazırlamışdır: 160-180 qram bədən kütləsi olan Sprague-Dawley xətli erkək siçovullara 2 həftə ərzində YYD (58% kalorili) təyin edilir, nəzarət qrupu heyvanlarına isə adi qida rasionu (12 % kalorili) tətbiq edilir. YYD təyinindən 2 həftə sonra eksperimental və nəzarət qrupu heyvanlarına kiçik dozada STZ (35 mq/kq) inyeksiya edilir. Müvafiq fonda YYD-da olan heyvanlarda nəzərəçarpacaq hiperqlikemiya, insulinopeniya, qan plazmasında triqliseridlərin və ümumi xolesterin konsentrasiyasının artması müşahidə edilir. Beləliklə müəlliflərin gəldikləri nəticəyə görə müvafiq model fonunda, insanlarda ŞD 2 tipinin patogenizinin gedişinə oxşar metobolik proseslər formalaşır, bu da müvafiq modelin antidiabetik maddələrin tədqiqində tətbiqi məqsədə uyğun hesab edilir [21]. Dünya əhalisi arasında ŞD 2 tipinin sürətlə yayılmasının nəzərə alaraq müasir farmakologiyanın ən aktual problemlərindən biri qalmaqdadır. Bu səbəbdən yeni prinsipli təsir mexanizmə malik olan, yüksək terapevtik effektli və nisbətən daha az əlavə təsirli antidiabetik preparatların alınması farmakologiya elminin qarşısında duran aktual məsələlərdən biridir [22, 23]. Bu maddələr sintetik və bitki mənşəli ola bilər. Yeni dərman maddələrinin alınması və ya onların yeni xüsusiyyətlərinin aşkara çıxarılması istiqamətində aparılan elmi tədqiqtların əsas mərhələsi, müvafiq maddələrin klinikayaqədərki tədqiqidir [24, 25]. Bu məqsədlə ŞD-nın eksperimental modelindən istifadə dərman maddələrnin bu və ya digər farmakoloji aktivliklərinin statistik dürüst olaraq aşkara çıxarılmasında mühüm yeri tutur. Sitotoksik agentlərin mədəaltı vəzin β-hüceyrələrinə müxtəlif mexanizmlərlə təsir göstərdiyinə görə, hər bir eksperimental model, farmakoloji birləşmələrin tədqiqinə uyğun olaraq özünə məxsus xüsusiyyətlərə malikdir. Eksperimental olaraq ŞD-nın modelləşdirilməsi məqsədilə geniş istifadə edilən digər kimyəvi maddə alloksandır. Alloksan 11 növ heyvanda ŞD-nın induksiyasını törədən diabetogen agentdir. Alloksan sidik cövhəri törəməsi olub, mədəaltı vəzin β-hüceyrələrinin nekrozunu törədir. Müvafiq kimyəvi maddə vasitəsilə dozasından asılı olaraq müxtəlif dərəcəli ŞD modeli yaradıla bilir ki, bu da ac qarnına qan plazmasında şəkər səviyyəsinin ölçülməsilə şərtlənir [26, 27]. Alloksanla törədilən kəskin diabet zamanı qandakı şəkər səviyyəsi pankeroektomiya fonundakı şəkər səviyyəsinə ekvivalentdir. Alloksanın qeyd edilən bütün növ heyvanaların hər bədən kütləsinə 140-180 mq/kq (150 mq/kq) dozada təyin edilir. Doşvanlarda qulaq venasına inyeksiyadan sonra qida və sudan azad istifadə şərtilə 7 gün, siçovullarda isə qarın boşluğuna inyeksiyadan sonra 12 gün fasilə verilir. Alloksan monohidratın 150 mq/kq dozası NaCl-in 0,9%-li fizioloji məhlulunda həll edilərək 18 saat ac saxlanılmış eksperimental siçovulların qarın boşluğuna yeridilir [28] və qanda qlükozanın səviyyəsi alloksan inyeksiyasından sonra müəyyən edilir. Alloksanın eksperimental dozasının seçilməsi xüsusi diqqət tələb edir. Belə ki, kimyəvi agentin dozası ilə mədəaltı vəzinin zədələnməsi düz mütənasibdir. Bu səbəbdən alloksanın ən çox istifadə edilən venadaxili dozası 65 mq/kq, qarın boşluğu və dərialtı yolla təyini zamanı onun effektiv dozası bir qədər artırılır [29] Ədəbiyat mənbələrində əks olunan ŞD modelləşmə üsullarının müxtəlifliyinə baxmayaraq, alimlər tərəfindən yeni-yeni ekspeimental modelləşmə üsulları işlənib hazırlanır. Həmçinin ŞD-nin adekvat modelləşməsi üsullarının hazırlanması antidiabetik maddələrin klinikayaqədərki tədqiqinin əsasını təşkil edir. Hər iki tip diabetlərin faramkoterapiyası zamanı istifadə edilən təbii və sintetik mənşəli yeni növ medikamentoz vasitələrin antidiabetik effektlərinin aşkara çıxarılması istiqamətində ən vacib mərhələ, insanda ŞD-nin patogenizinə uyğun modelinin yaradılmasından ibarətdir.

 

 

 

ƏDƏBİYYAT - ЛИТЕРАТУРА– REFERENCES:

 

1. King A., Bowe J. Animal models for diabetes: Understanding the pathogenesis and finding new treatments // Biochem Pharmacol; 2016; 1(99); p. 1-10; doi: 10.1016/j.bcp.2015.08.108

2. Barrière D.,  Noll C., Roussy G., et al. Combination of high-fat/high-fructose diet and low-dose streptozotocin to model long-term type-2 diabetes complications // Scientific Reports.; 2018; 424 (17); p.26-38; doi:10.1038/s41598-017-18896-5

3. Masiello P. Animal models of type11 diabetes with reduced pancreatic β-cell mass // The international J. of Biochem. and Cell Biology; 2006; 38; p. 873-893.

4. Lenzen S. The mechanisms of alloxan- and streptozotocin-induced diabetes // Diabetologia; 2008; 51 (2); p. 216-226.

5. Fontaine D., Davis D. Attention to Background Strain Is Essential for Metabolic Research: C57BL/6 and the International Knockout Mouse Consortium // Diabetes; 2016; 65(1); p.25–33; doi: 10.2337/db15-0982

6. Nandipati K., Subramanian S., Agrawal D. Protein kinases: mechanisms and downstream targets in inflammation-mediated obesity and insulin resistance // Mol Cell Biochem.; 2017; 426(1-2); p. 27-45. doi: 10.1007/s11010-016-2878-8

7. Damasceno D., Netto A., Iessi L., et al. Streptozotocin-Induced Diabetes Models: Pathophysiological Mechanisms and Fetal Outcomes // BioMed Research International; 2014; 819065; p. 11-23; doi.org/10.1155/2014/819065

8. Kraynak A., Storer R., Jensen R., et al. The mechanisms of alloxan- and streptozotocin-induced diabetes // Diabetologia; 2008; 12; p.123–128.

9. Goyal S., Reddy M., Patil K. Challenges and issues with streptozotocin-induced diabetes e Aclinically relevant animal model to understand the diabetespathogenesis and evaluate therapeutics // Chemico-Biologic al Interactions Chemico-Biological Interactions; 2016; 244; p. 49-63

10. Qian C., Zhu C., Yu W., et al. High-Fat Diet/Low-Dose Streptozotocin-Induced Type 2 Diabetes in Rats Impacts Osteogenesis and Wnt Signaling in Bone Marrow Stromal Cell // PLoS One. 2015; 10(8); e0136390; doi: 10. 1371/journal. pone. 0136390

11. Северина С.Е., Соловьёвой Г.А. Практикум по биохимии: Учеб. пособие.- 2-е изд., Перераб. и доп. - М .: Изд-во МГУ, 1989. - 509 с.

12. Furman B. Streptozotocin-Induced Diabetic Models in Mice and Rats // Current protocols in Pharmacology; 2015; 70(1); p. 47-53; doi.org/10.1002/0471141755

13. Fröde T., Medeiros Y. Animal models to test drugs with potential antidiabetic activity // J. Ethnopharmacol.; 2008; 115(2); p.173-183

14. Iglesias P., Oidor-Chan V., EmanuelLoeza-Alcocer E., et al Evaluation of the neonatal streptozotocin model of diabetes in rats: Evidence for a model of neuropathic pain Pharmacological Reports // 2018; 70 (2); p. 294-303; doi.org/10.1016/j.pharep.2017.09.002

15. Mostafavinia A., Amini A., Ghorishi S. The effects of dosage and the routes of administrations of streptozotocin and alloxan on induction rate of type1 diabetes mellitus and mortality rate in rats // Lab. Anim. Res.; 2016; 32(3); p. 160-165

16.Тюренков И.Н., Куркин Д.В., Волотова Е.В. и др. Десять новых мишеней для разработки лекарственных средств для лечения СД2 и метаболического синдрома // Сахарный диабет. 2015;(1):101-109

17. Cui W., Zheng Y., Zhang Q. et al. Low-molecular-weight fucoidan protects endothelial function and ameliorates basal hypertension in diabetic Goto-Kakizaki rats // Laboratory Investigation; 2014; 94; p. 382– 393; doi: 10.1038/labinvest 

18. Arias-Mutis O., Marrachelli V., Ruiz-Saurí A. et al. Development and characterization of an experimental model of diet-induced metabolic syndrome in rabbit // PLoS one; 2017; 12(5); e0178315; doi.org/10.1371/journal.pone.0178315    19. Skovso S. Modeling type 2 diabetes in rats using high fat diet and streptozotocin // J Diabetes Invest., 2014; 5; p. 349–358; doi:10.1111/jdi.12235

20. Спасов А.А., Бабков Д. А., Мулеева Д.Р. Моделирование сахарного диабета типа 2 у крыс на высокожировой диете с индукцией стрептозотоцином // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета; 2017; 1 (61); c. 30-37

21. Srinivasan K., Viswanad B., Asrat L. et al. Combination of high-fat diet-fed and low-dose streptozotocin-treated rat: a model for type 2 diabetes and pharmacological screening // Pharmacol. Res. 2005. Vol. 52. P. 313-320.   

22. Binh D., Dung N., Le Thao T. et al. Macro- and Microvascular Complications of Diabetes Induced by High-Fat Diet and Low-Dose Streptozotocin Injection in Rats Model // International Journal of Diabet es Research; 2013, 2(3); p. 50-55; doi: 1 0.5923/j. diabet es 20130203.03

23. Cristina Aguayo-Mazzucato C., Weir S. Pancreatic β Cell Regeneration as a Possible Therapy for Diabetes // Cell Metabolism; 2018; 27 (1); p57–67; doi: https://doi.org/10.1016/j.cmet.2017.08.007

24. Al-awar A., Kupai K., Veszelka M. Experimental Diabetes Mellitus in Different Animal Models // Journal of Diabetes Research; 2016; 9051426; p. 12-21;doi.org/10.1155/2016/9051426

 25. Чуканова Г.Н., Дворацка М.K., Искакова С.С. Моделирование сахарного диабета 2 типа для изучения лекарственных средств с антидиабетической активностью // Наука и здравоохранение; 2014; 4; c.4-10

26. Ejiofor C., Ezeagu I., Ayoola M. et al. Histopathological effect of aqueous extract of Persea americana seed on alloxan- induced diabetic rats // Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry; 2018; 7(1); p. 795-799

27. Ojiako O., Chikezie P., Ogbujim A. Blood glucose level and lipid profile of alloxan-induced hyperglycemic rats treated with single and combinatorial herbal formulations // J Tradit Complement Med. 2016; 6(2); p.184–192; doi: 10.1016/j.jtcme.2014.12.005

28. Rohilla A., Ali S. Alloxan Induced Diabetes: Mechanisms and Effects // Inter. J. of Res. Pharma. Biomed. Sci.;  2012; 3 (2); p. 819-823  

29. Radenković M., Stojanović M., Prostran M. Experimental diabetes induced by alloxan and streptozotocin: The current state of the art. // J. Pharmacol. Toxicol. Methods.; 2016;78; p.13-31; doi: 10.1016/j.vascn.2015.11.004