ИММУННЫЕ ЭФФЕКТОРНЫЕ ПЕПТИДЫ

10-10-2018

Антимикробные пептиды или защитные пептиды организма являются фундаментальными компонентами врожденного иммунитета человека, которая включает распознавание, фагоцитоз и переваривание патогенов, индукцию воспаления и представление антигенов. Ранние и новые данные свидетельствуют о том, что они играют определенную роль в широком спектре заболеваний [1,2]. Антимикробные пептиды (АМП) экспрессируются в клетках (эпителии, нейтрофилах и макрофагах), которые вступают в контакт с потенциально инвазивными микроорганизмами [1-4].

Одним из основных классов АМГ1 являются дефенсины. Продуцируемые различными типами клеток, в том числе нейтрофилами и эпителиальными клетками, дефенсины - это небольшие, многофункциональные катионные пептиды. Они обычно содержат шесть консервативных цистеинов, три внутримолекулярных дисульфида стабилизируют структуру. В зависимости от структуры образования дисульфидных мостов между шестью консерватив-ными остатками цистеина различают альфа, бета и тета (α, β и θ) дефенсины [1-4].

В 1985 году Selsted et al. сначала изолировали зрелую форму семейства α-дефенсинов из человеческой крови, обозначая их как человеческие нейтрофильные пептиды (human neutral peptide - HNP) в соответствии с их источником, свойством и размером. Вскоре были выделены три типа HNP (HNP-1, HNP-2 и HNP-3), имеющие почти идентичные аминокислотные последовательности [5]. В 1989 г. после очистки до гомогенности хроматогра-фиическими методами сообщалось о четвертом типе HNP-4. В 1989 и 1992 годах гены α-дефенсин были экстрагированы из клеток мыши и человека и назывались соответственно HD-5 и HD-6 [6].

Дефенсины обладают интенсивной антимикробной активностью, убивая широкий спектр микроорганизмов, включая бактерии, вирусы и грибы [1-4].

Как это ни парадоксально, индукция дефенсинов совершается самим микроорганизмом, который они убивают, и эта индукция находится под жестким генетическим контролем как врожденной иммунной системой, так и в генах дефенсина, их ферментах обработки и их генах. Эндогенное продуцирование дефенсинов является одним из первых линий защиты в врожденном иммунитете против вирусов. Каждый класс дефенсинов (α, β и θ) имеет свою собственную структуру, типы клеток, которые производят дефенсины и способ индукции и обработки. Только β-дефенсины создаются последовательно через позвоночных видов, но эволюционио производятся от предкового дефенсина, называемого «большой дефенсин» [1,6,7].

У людей β-дефенсины конститутивно экспрессируются в различных слизистых и эпителиальных клетках, где их можно регулировать в ответ на инфекционные и воспалительные стимулы [8,9].

Человеческий β-дефенсин (HBD)-l представляет собой антимикробный пептид, существующий в нескольких формах в пределах от 36-47 аминокислот (аа) и кодируется геном DEFB1 [8,9]. Ген HBD-1 экспрессируется главным образом в урогенитальном тракте и, в меньшей степени, в трахее и легких [8,9]. Выявленные формы зависели оттого, где в теле они были изолированы. В плазме крови Valore et al. обнаружили, что множественные формы HBD-1 (36-47 аа) связываются с молекулами-носителями, которые выделяют каждую пептидную форму в кислых условиях. Используя in situ гибридизацию, они локализуют мРНК HBD-1 в эпителиальных слоях петель Генле, дистальных канальцев и собирающих протоков почек, поджелудочной железы и эпителиальных слоев влагалища, эктоцервикса, эндоцервикса, матки и фаллопиевых труб в женском репродуктивном тракте [9,10]. Все формы HBD-1 обладают антимикробной активностью, но имеют переменную активность в испытуемых условиях, например, различную осмоляльность или окислительно-восстановительное состояние [8,9]. Классически HBD-1 известен как конститутивно продуцируемый (β- дефенсин в эпителиальных клетках [11], продуцируемый главным образом эпителиальными клетками в почках [12], легких, женском репродуктивном тракте, других органах слизистых и кожи [11,12]. Считается, что он имеет защитный эффект против вторгшихся организмов, помогая обеспечить первородную врожденную иммунную защиту от них [12]. Однако это стационарное производство HBD-1 не всегда имеет место, так как HBD-1 индуцибельно при правильных условиях. В то время как DEFB4 (который кодирует HBD-2) и DEFB103 (который кодирует HBD-3) демонстрирует вариабельность числа копий, что может привести к изменению экспрессии генов и уровней пептидов между индивидами, HBD-1, по-видимому, не обладает такой изменчивостью [11,12], Возможно, различия в базальном и индуцированном уровнях экспрессии, скорее всего, обусловлены другими факторами. Индуцирование HBD-1 сильно зависит от стимулированного типа клетки, времени отбора проб после стимуляции, биомолекулы или организма, вызывающего ее, независимо от того, жив ли организм или нет, и окружающей среды и контекста клетки [2,4].

L.K.Ryan, G.Diamond [1], отмечают более сложную роль HBD-1. Авторы приводят данные о том, что HBD-1 индуцибелен с помощью другого типа стимулов, чем другие HBD, и что люди реагируют на разные типы раздражителей по-разному, предлагая сильный генетический компонент в этом врожденном иммунном ответе на вирусы и другие микробы. Сигнальный путь индукции HBD-1 (выраженный DEFB1) отличается от сигнального пути HBD-2 и HBD-3.

Первый β-дефенсин, который был охарактеризован как индуцируемый, происходил в эпителиальных клетках трахеи у крупного рогатого скота и назывался антибактериальным пептидом трахеи (АПТ), индуцированным липополисахаридом (ЛПС) и провоспалитсльными цитокинами, фактором некроза опухоли (ФНО) и интерлейкином (ИЛ) - 1β через путь ядерного фактора кВ (NF-kB) [13,14]. Затем последовал гомолог человека: ЛПС, как было показано, индуцирует HBD-2 в эпителиальных клетках дыхательных путей [1,14]. Многие другие типы эпителиальных клеток слизистой оболочки, например, в желудочно-кишечном тракте, также были мишенями для индукции ЛПС или провоспалительных цитокинов HBD-2 [14]. Показано, что индукция HBD-2 ЛПС опосредована через Тоll-подобный рецептор (TLR) 4 и последующая стимуляция пути NF-кВ [1,13,14].

Первым исследованием, показывающим изменчивость и индуцибельность β-дефенсинов в моноцитарных клетках, было исследование, проведенное Duits et al. [1]. Они изучали экспрессию гена НВD-1 и НВD-2 с использованием полуколичественной обратной транскрипционной полимераз-ной цепной реакции (RT-PCR) в моноцитах, макрофагах, полученных из моноцитов (МDМ) и альвеолярных макрофагах (АМ), а также дендритных клетках, полученных из моноцитов (МDDС), полученных из моноцитов с использованием гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GМ-СSF) и ИЛ-4. Инкубация с ЛПС и интерферона (ИФН)-γ увеличивала мРНК hВD-1 дозозависимым образом в моноцитах и МDМ, но АМ продолжал выражать один и тот же уровень НВD-Р НВD-2 увеличился в моноцитах по мере их созревания до МДМ, но НВD-2 не увеличивался по мере того, как незрелые МDDС созрели до типа 1 или 2-го типа. У АМ были не только умеренные уровни экспрессии НВD-2, по и ЛПС и ИФН [1,13].

Первый β-дефенсин был обнаружен при изучении почки человека из диализата гемофильтрата и описан в начале 1990-х годов. Это был пептид из 36 аминокислотных остатков (НВD1) [2,4]. Основными β-дефенсинами человека являются НВD-1-6. Сегодня известно, что молекулы β-дефенсинов - более вариабельные пептиды, они менее консервативны в аминокислотной последовательности. Кроме того, НВD найдены в различных изоформах [1,3,4].

Основными продуцентами β-дефенсинов являются кератиноциты, эпителиоциты слизистых оболочек, макрофаги, моноциты, дендритные клетки [3,4]. α-дефенсины - классические «нейтрофильные» дефенсины (НNР), были идентифицированы в азурофильных гранулах нейтрофилов и впервые описаны в середине 1980-х годов. Гранулы нейтрофилов являются основным депо для четырех α-дефенсинов (НNР1-4), два α-дефенсина - НD5 и НD6 - выявлены в клетках Панета. Секретируемые нейтрофилами а-дефенсины можно обнаружить в биологических жидкостях [1].

Активация нейтрофилов при инфекционных и воспалительных процессах приводит к быстрому высвобождению дефенсинов, которые затем обнаруживаются в плазме и других жидкостях организма. В нормальной плазме обнаруживается очень низкий уровень дефенсинов (от неопределяемых величин до 50-100 нг/мл), однако в условиях сепсиса содержание их может возрасти до 10 мг/мл и даже выше [3,4].

Таким образом, модуляция экспрессии гена HBD-1 при вирусной инфекции происходит по различным сценариям и зависит от факторов окружающей среды хозяина. Имеются данные о том, что эта модуляция может влиять на результат вирусного заболевания. Кроме того, было показано, что генетические мутации в промоторе HBD-1 влияют на восприимчивость к вирусным заболеваниям; и, возможно, способность моноритарных клеток реагировать на вирус с помощью HBD-1 в дополнение к ИФН-α может влиять на восприимчивость клеток-хозяев к заражению вирусом. Исследования в этой области находятся в зачаточном состоянии. Больше исследований для понимания регуляции экспрессии генов и трансляции белка эндогенных антимикробных пептидов, особенно HBD-1, приведет к улучшению терапевтических возможностей для борьбы с вирусной инфекцией, иммуни-тетом и патогенезом. Исследования клеточной культуры, показали, что α-дефенсины влияют на вирусную инфекцию с помощью различных механизмов. Несмотря на некоторое сходство, большое количество антивирусных механизмов, описанных на сегодняшний день, подчеркивает специфику взаимодействия дефензин-вирус. В ограниченных исследованиях in vivo роль α-дефенсинов, по-видимому, отлична от их сильно противовирусной активности in vitro. Хотя иммуномодулирующие, адъювантные и хемокиновые свойства уже давно приписываются дефенсинам, важность этих функций in vivo подчеркивает необходимость проведения дополнительных исследований в этих областях. Важным элементом врождённого иммунитета является лактоферрин, представляющий собой полифункциональный белок из семейства трансферринов. Лактоферрин - это глобулярный гликопротеин с молекулярной массой около 80 кДа и широко представлен в различных секреторных жидкостях, а также в плазме крови, нейтрофилах. Будучи одним из компонентов иммунной системы организма, участвует в неспецифическом гуморальном звене иммунитета, регулирует функции иммунокомпетентных клеток и является белком острой фазы воспаления [15].

Белок взаимодействует с ДНК и РНК, полисахаридами, гепарином, причем некоторые из своих биологических функций лактоферрин проявляет в виде комплексов с этими лигандами [15,16].

Согласно данным рентгеноструктурного анализа лактоферрин образован одной полипептидной цепью, содержащая 692 аминокислотных остатка и образует два гомологичных глобулярных домена, называемых N- и С-долями (N- доля, остатки 1-333; С-доля, остатки 345-692), концы которых соединены короткой α-спиралью нейтрофилах [15,16]. Каждая доля состоит из двух доменов N1, N2 и С1, С2 и содержит один железосвязывающий сайт и один сайт гликозилирования. Степень гликозилироваиия белка может быть различной. Именно поэтому молекулярная масса белка по разным данным составляет от 76 до 80 кДа. Было показано, что устойчивость лактоферрина к деградации протеазами или при низких значениях pH обусловлена высокой степенью гликозилирования белка [16].

Лактоферрин относится к щелочным белкам, его изоэлектрическая точка составляет 8.7. Белок существует в двух формах - железонасыщенной (холо-ЛФ) и железопенасыщенной (апо-ЛФ). Их третичные структуры различны; для апо-ЛФ характерна “открытая” конформация Т9-доли и “закрытая” конформация С-доли, а для холо-ЛФ характерна закрытая конформация обеих долей [15,16]. Каждая молекула белка может обратимо связывать два иона трехвалентного железа или ионы цинка, меди и других металлов [15,16]. Центры связывания локализованы в каждой из двух белковых глобул, составляющих молекулу лактоферрина. В каждой доле атом железа скоординирован с шестью лигандами, четыре из которых предоставлены цепью полипептида (два остатка тирозина, один остаток гистидина и один остаток аспарагиновой кислоты), а оставшиеся две связи железо образует с ионом карбоната или бикарбоната [15].

Как в плазме крови, так и в секреторных жидкостях лактоферрин может существовать в виде различных полимерных форм от мономера до тетрамера, однако обнаружено, что доминирующей формой лактоферрина в физиологических условиях является тетрамер; соотношение мономер: тетрамер при концентрации белка 10^{-5 М составляет 1:4 [16].}

Имеются данные о том, что лактоферрин опосредованно вовлечен в процессы клеточного иммунитета. Главные биологические функции белка - это связывание и транспорт ионов железа, но кроме этого лактоферрин обладает антибактериальной, антивирусной, антипаразитарной, различными каталити-ческими активностями, а также противораковым, антиаллергическим, иммуномоделирующим действиями и радиопротективными свойствами [15,16].

Наиболее изученным является механизм антибактериальной активности лактоферрина. Установлено, что механизмы антибактериального действия лактоферрина напрямую зависят от железосвязывающих свойств белка. Вместе с тем в основе антиинфекциониой активности лактоферрина могут лежать и другие механизмы, не зависящие от способности белка связывать ионы железа, например стимулирующее действие лактоферрина на фагоцитоз и влияние на активность комплемента [15,16]. Однако наиболее изученным механизмом антибактериального действия белка, не зависящим от его железосвязывающей способности, является специфическое взаимодействие лактоферрина с наружной бактериальной мембраной, которое приводит к гибели клеток бактерий [15]. Показано, что белок разрушает бактериальную мембрану и даже проникает внутрь клетки [15,16]. Помимо этого, лактоферрин обладает антивирусной, антигрибковой, ферментативной активностью, взаимодействует с нуклеиновыми кислотами [15].

В тоже время роль лактоферрина в защите от инфекции и других противовоспалительных реакциях до настоящего времени полностью не определена. Длительное время существовала точка зрения о том, что белок вызывает бактериостатические эффекты, отнимая железо у бактериальной клетки [16]. Один из механизмов участия лактоферрина в антибактериальной защите может заключаться в блокировании реакции гемагглютинации, вызываемой энтеротоксином при инфицировании кишечной палочкой, что, вероятно, происходит с участием бактериальной оболочки [15,16].

Впервые мнение об участии лактоферрина в формировании иммунного ответа было описано в 1980 г. [15]. Почти все механизмы активации иммунитета белком проходят этап его полного контакта с клеточными мембранами. Данный факт связан с наличием специфических рецепторов к лактоферрину, являющихся основными чувствительными окончаниями процесса интернализации, сигнала клеток и транспорта белка в ядерный центр клетки [1-5,16]. Но есть и противоречивые результаты изучения этих процессов. Доказано, что лактоферрин может контролировать активность лимфоцитов, их созревание, дифференцирует изолированные В-лимфоциты и клетки тимуса, а также, связываясь с Т-лимфоцитами, ускорять экспрессию СD4 антигеном [16].

Важной функцией лактоферрина считается усиление разрушающего действия клеток. Экспрессируя на зрелых нейтрофилах, протеин участвует в связывании разнообразных микроорганизмов [16]. Освобождение лактоферрина из гранул возникает после индукции нейтрофилов ФHО [16], а часть протеина связывается с поверхностью нейтрофилов. Связанный и свободный лакто-феррин увеличивает фагоцитоз моноцитов/макрофагов и нейтрофилов [16].

Установлено, что лактоферрин - это промотор клеточной активности, продукции - оксида азота, ФHО, ИЛ-8 и образования супероксидов [16]. Некоторыми авторами отвергается, что лактоферрин способствует активизации нейтрофилов, поскольку он тормозит классическую и одновременно усиливает альтернативную реакцию комплемента. Другими авторами, напротив, показано, как белок подавляет классическую реакцию, но не альтернативную комплементу. Демонстрируется эта активность и при связывании протеина с нейтрофилами [15,16].

Таким образом, имеющиеся в литературе сведения подтверждают данные о лактоферрине как о маркерном белке специфических гранул нейтрофилов острой фазы воспаления. При хронических воспалительных процессах вне фазы обострения концентрация белок не изменяется. При этом уровень протеина коррелирует с числом нейтрофилов и, в ряде случаев, с содержанием других белков острой фазы. Показано, что лактоферрин может подавлять макрофаги, а именно их активность, в результате чего тормозится синтез антител В-лимфоцитами. Установлена способность протеина тормозить действие СЗ-компонента комплемента с иммунными комплексами. Следовательно, доказано участие лактоферрина в регуляции клеточных и гуморальных иммунных механизмов. Также доказаны антиоксидантные, мембранопротекторные, бактериостатические и бактерицидные свойства лактоферрина.

Установлено, что на формирование иммунного ответа влияет и 3- нитротирозин [17]. Нитротирозин был идентифицирован как индикатор повреждения клеток и воспаления, а также образования оксида азота (N0). Нитротирозин является относительно стабильным продуктом, образованным из различных путей реакции. Одна из них - реакция пероксинитрита с тирозином. Пероксинитрит, образованный из радикалов супсроксида и оксида азота, опосредует реакции нитрования тирозина на белки, приводящие к инактивации некоторых ферментов, поддерживающих домохозяйство, а также эндогенные антиоксидантные ферменты, такие как каталаза и супероксиддисмутаза. Нитротирозин был вовлечен в патогенез многих воспалительных, инфекционных и дегенеративных заболеваний человека, включая атеросклероз (образование атеросклеротических бляшек), заболевания ЖКТ (целиакию), ревматоидный артрит, хроническую почечную недостаточность и септический шок. В норме в плазме присутствуют низкие, неопределяемые уровни нитротирозина [17].

Нитротирозин образуется в присутствии активных метаболитов N0. Различные биохимические пути, включая образование пероксинитрита, приводят к образованию этого соединения. Так как он является стабильным эндопродуктом окисления пероксинитрита, определение его концентрации в плазме может быть использовано в качестве полезного маркера NO-зависимых повреждений in vivo. Вследствие того, что NOx является единственным индикатором усиления продукции NO, белок, связанный с нитротирозином, может служить более полезным маркером повреждений, индуцированных реактивными интермедиатами азота, происходящими из NO. Более того, большинство белков имеет более долгий период полужизни, чем NOx [17].

Образование нитротирозина представляет собой специфическую модификацию белка, опосредованного пероксинитритом; таким образом, обнаружение нитротирозина в белках рассматривается как биомаркер для эндогенной активности пероксинитрита. Пероксинитрит-окисление и нитрова-ние биомолекул могут приводить к аутоиммунным заболеваниям, т.е. к генерации аутоантител к собственным белкам при различных аутоиммунных нарушениях.

Таким образом, рассмотренные пептиды являются важнейшими компонентами врожденной иммунной системы и остаются целью исследования многих научно-практических работ.

 

ƏDƏBİYYAT - ЛИТЕРАТУРА– REFERENCES:

1.Ryan LK, Diamond G. Modulation of Human β-Defensin-l Production by Viruses. Viruses. 2017; 9(6), 153-162. doi:10.3390/v9060153.
2.Коновалова M.B., Зубарева А.А., Луценко Г.В., Свирщевская Е.В. Антимикробные пептиды в норме и при патологиях (обзор). Прикладная биохимия и микробиология. 2018; 3:236-243.
3.Азимова В.Т., Потатуркина-Нестерова Н.И., Нестеров А.С. Эндогенные антимикробные пептиды человека. Современные проблемы науки и образования. 2015; 1-1.; URL: http://science-education.ru/ru/article/view7id-17746.Окороченков СА, Желтухина ГА, Небольсин BE. Антимикробные пептиды: механизмы действия и перспективы практического применения. Биомедицинская химия. 2012; 58(2): 131-143.
4.Swain N, Pathalc J, HosalkarRM. Defensin. Encyclopedia of Signaling Molecules, 2017; 1339-1345 DOT: https://doi.org/10.1007/978-3-319-67199-4_102004.
5.LehrerRI, Lu W. alpha-Defensins in human innate immunity. Immunol. Rev.2012; 245: 84-112. doi: 10.1111/j. 1600-065X.201 1.01082.x.
6.Wilson SS, Wiens ME, Holly MK, Smith J.D. Defensins at the Mucosal Surface: Latest Insights into Defensin-Virus Interactions. J. Virol. 2016, 90, 5216-5218. doi: 10.1128/J VI.00904-15.
7.Zhu S, Gao B. Evolutionary origin of beta-defensins. Dev. Comp. Immunol. 2013; 39: 79-84. doi: 10.1016/j.dci.2012.02.011.
8.Mchlotra, R.K.; Zimmerman, P.A.; Weinberg, A.; Jurevic, R.J. Variation in human beta-defensin genes: New insights from a multi-population study. Int. J. Immunogenet. 2013; 40: 261-269.
9.Prado Montes de Oca E. Antimicrobial peptide elicitors: New hope for the post­antibiotic era. Innate Immun. 2013; 19:227-241. doi: 10.1177/1753425912460708.
10.Sousa FH, Casanova V, Stevens C, Barlow PC. Antiviral host defence peptides. In Host Defense Peptides and Their Potential as Therapeutic Agents; Epand R.M., Ed.; Springer: Switzerland. 2016: 57-94.
11.Wiens ME, Wilson SS, Lucero CM, Smith JG. Defensins and viral infection: Dispelling common misconceptions. PLoS Pathog. 2014; 10, el004186.
12.Oh D.-j., Kim H.R., Lee M.-K, Woo Y.S. Proflie of Human β-Defensins 1,2 and Proinflammatory Cytokines (TNF-α, IL-6) in Patients with Chronic Kidney Disease. Kidney Blood Press Res. 2013; 37: 602-610, https://doi.Org/10.1159/000355740.
13.Guani-Guerra E, Santos-Mendoza T, Lugo-Reyes SO, Teran LM Antimicrobial peptides: General overview and clinical implications in human health and disease. Clinical Immunology. 2010; 135 (1): 1-11. https://doi.Org/10.1016/j.clim.2009.12.004.
14.Actor JK., Shen-An Hwang, Kruzel ML. Lactoferrin as a Natural Immune Modulator. CurrPharm Des. 2009; 15(17): 1956-1973.
15.Кузнецов И.А., Потиевская В.И., Качанов И.В., Куралева О.О. Роль лактоферрина в биологических средах человека. Современные проблемы науки и образования. 2017; 3: URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=26522
16.Ahsan H. 3-Nitrotyrosine: A biomarker of nitrogen free radical species modified proteins in systemic autoimmunogenic conditions. Hum Immunol 2013;74( 10): 1392-1399. doi: 10.1016/j.humimm.2013.06.009.
17.Oгородова Л.М., Петрова И.В., Рукин К.Ю. Влияние 3-нитротирозина на формирование субпопуляции Т-регуляторных клеток при воспалении дыхательных путей. Научные ведомости Белгородского государственного университета. 2011; 15(6): 78-82.