SAĞLAMLIQ

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КРАТКОВРЕМЕНОГО И ДОЛГОВРЕМЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ЭТАНОЛА НА ГЛУТАМИНОВУЮ СИСТЕМУ ТКАНИ ГИПОТАЛАМУСА В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

10-09-2018

В комплексе медико-биологических проблем последних десятилетий особое место занимает исследование широкого диапазона вредного влияния алкоголя (этиловый спирт, этанол) на состояние здоровья как самого злоупотребляющего алкогольными напитками, так и на здоровье его потомства, отрицательного воздействия на благосостояние семьи и общества.

На протяжении всего периода развития центральной нервной системы (ЦНС), в постнатальном онтогенезе, в структурах и клеточных образованиях головного мозга формируется весьма сложный механизм биохимической организации метаболизма свободных аминокислот, в том числе нейро медиатор ных аминокислот. Основные нейрональные и глиальные метаболические пути и звенья так или иначе тесно сопряжены с обменом аминокислот, мозгоспецифический метаболический фонд которых формируется в основном за счет ферментативного расщепления эндогенных белков мозга до аминокислот и поступления свободных аминокислот в мозг извне и в результате их ресинтеза в самой ткани мозга (1,2,3,6). В ряд важнейших аспектов изучения действия алкоголя (этиловый спирт) на тонкоструктур-ные,молекулярно-клеточные, функциональные и защитно-приспосо бительные основы ЦНС, важно место занимают вопросы исследования влияния этого весьма эффективного нейротропного агента нейромедиаторные механизмы мозгах [3,6,10]. В этом контексте по важности в один ряд стоят вопросы по изучению действия разных концентраций алкоголя (этилового спирта, этанола) на глубинные нейрохимические процессы, специфичные для всей деятельности мозга. Для исследователей, изучающих влияние алкоголя на мозг особый интерес представляют последствия действия этилового спирта на молекулярные нейроме диаторные механизмы центральных нервных структур, обладающие широким спектром синаптических и внесинаптических эффектов возбудительного, тор мозного и модулирующего характера.

Согласно новой концепции о биохимической организации живых систем (2,6), молекулярно – метаболические и физиологические основы деятельности организма и отдельных его органов и систем определяются как совокупность принципов и механизмов формирования структурной, метаболической и функ циональной организации и регулирования. Данная концепция исходит из того, что биохимическая организация, это единство структуры, метаболизма, функций и регуляции для каждой высокоразвитой морфо – функциональной системы.

По мнению специалистов в области изучения процессов развития пристрастия к алкоголю ,алкогализма и алкоголных психозов ,ведущую роль играет хроническое влияние спиртного на ЦНС организма [6,8].В ряд важнейших аспектов изучения действия алкоголя (этиловый спирт) на тонкоструктурные, молекулярно-клеточные, функциональные и защитно-приспособительные основы ЦНС, важно место занимают вопросы исследования влияния этого весьма эффективного нейротропного агента нейромедиаторные механизмы мозгах [8,10]. Однако, до настоящего времени не совсем четко представляется вся сложная картина действия алкоголя на метаболизм и функции нервных клеток, возникающая при систематическом (хроническом) употреблении его в малых или высоких дозах и сопровождаемая рядом нейротоксических эффектов. В литерату ре имеется лишь небольшое количеств работ, касающихся изуче нию влияния алкоголя на ГК-ГАМК метаболический цикл мозга немногочис ленны и недостаточны для более подробного анализа данного процесса.

Целью настоящего исследования явилось изучение влияние однократного и хронического перорального введения этанола на активность ключевых ферментов обмена глутаминовой кислоты(ГД) и ГАМК-глутаматдекар-боксилазы (ГДК) и ГАМК аминотрансферазы (ГАМК) в гипоталамусa экспериментальных живот ных в постнатальном онтогенезе.

Материалы и методы исследования.Согласно разработанной нами схеме исследования,опыты проводили на крольчатах 2-3-х месячного возраста и кроликах 6-месячного,годовалого и 2-х годовалого возраста. Исследавали содержания нейромедиаторных аминокислот ных-аспарата,глутамата и ГАМК, а такжеактивность ферментов и их обмена -ГДК и ГАМК-Т-азы супернатантах, цитозольной фракциях гипоталамуса после однократного введения в желудок животных этилового спирта (95%-ный) в дозе 4 и 6 г/кг массы тела,многократного введения (в течении 7 дней,через день) в дозе 8 г/кгмассы тела и его раствора (40%-ный)в дозе 8 г/кг массы тела. Определение содержания аминокислот и активность ферментов и их обмена осушестевляли через 1 и 3 часа после однократного введения 95%-ного этилового спирта,через 2 и 4 дня после многократного введения и через 2 часа после однократного введения его 40%-ного раствора. Выведение амино кислот и их количественное определение производили методом высоковольт ного электрофореза на бумаге (4) и фотометриическим методом,белка-по методу Lowry R.H.et al.(9). Для определения активности ферментов ГДК и ГАМК-Т использовали методические указания Doze K. (7).Полученные данные обработивали параметрическим способом (5).

Результаты иссдедований и их обсуждение.Нами установлено,что содер жания ГК, ГАМК, ГДК, ГАМК-Т в тканях гипоталамусе у 3-х месячных и годова лых крольчат после 1 и 3 часа введения этанола в дозе 4 и 6 г/кг (95%-ного этилового спирта) массы тела животного существенно изменяют содержания ГК, ГАМК, ГДК и ГАМК-Т в цитозоле тканей гипоталамусе (таб.1), что свидетельст вует о достаточно высокой реактивности развивающегося мозга к воздействиям алкоголя и других токсических веществ (1,6,8). Некоторые авторы утверждают, что при длительных воздействиях алкоголя на растущий организм могут происходить нарушения в энергетическом обмене, белковом синтезе, дисбаланс в содержании, следовательно, в синтезе и превращениях нейромедиаторных веществ (6,8,10).

Далее мы провели опыты на 3-х месячных крольчатах, у которых исследовали также активность ферментов обмена вышеуказанных нейромедиа-торных аминокислот в гомогенатах тканей гипоталамусе (таб. 2).

Таблица  №1

Содержание ГК, ГАМК и общая активность ГДК и ГАМК-Т в цитозоле тканей мозга 3-х месячных и годовалых кроликов-самцов при воздействии этанола в дозе 4 и 6 г/кг массы тела (M±m).

Структуры мозга	Время опыта, в ч.	Возраст
		3-х месячный				годовалый
		Показатели
		ГК	ГАМК	ГДК	ГАМК-Т	ГК	ГАМК	ГДК	ГАМК-Т
Гипоталамус	Контр.	3,9±0,16	1,7±0,04	66,4±2,9	60,3±3,2	4,6±0,23	1,73±0,05	72,2±1,7	78,6±3,1
	1 ч	3,3±0,11	2,1±0,03	68,2±3,1	59,1±1,29	4,0±0,19	1,92±0,06	72,9±1,3	78,9±2,3
	3 ч	3,0±0,18*	2,9±0,06**	72,3±2,2*	55,6±1,18	2,3±0,16*	2,8±0,06*	78,8±2,0*	76,2±1,9

Примечание: количество ГК и ГАМК выражено в мкмолях/г ткани, активность ГДК и ГАМК выражена соответственно в мкмолях ГАМК/г ткани/ч инкубации и мкмолях ГК/г ткани/ч инкубации. Звездочками (* и **) обозначена достоверность данных (р) по отношению к контролю в величинах  <0,05-<0,01.

Таблица  №2

Изменение содержания АсК, ГК, ГАМК и общей активности ГДК и ГАМК-Т в гомогенатах тканей гипоталамусе 3-х месячных кроликов-самцов после введения этанола в дозе 6 г/кг массы тела (М±m, п=8)

Структуры мозга	Время опыта, в ч.	Показатели
		АсК	ГК	ГАМК	ГДК	ГАМК-Т
Гипоталамус	Контроль	3,4+0,17	5,2±0,13	1,9±0,03	67,5±3,45	65,3±1,42
	1ч	3,0±0,15	5,1+0,27	1,70±0,02	68,9±2,32	69,4±2,35
	Зч	2,9±0,03	3,60+0,11*	0,81±0,04*	69,3±2,11*	71,5±2,46**

Примечание :Звездочками (* и **) обозначена достоверность данных по отношению к контролю в значениях р<0,05ир<0,01.

 

Установлено, что у 3-месячных кроликов через 1 час после однократного введения этанола в дозе 6 г/кг массы тела, общая активность ГДК незначите льно возрастает в цитозоле гипоталамуса.К этому сроку активность ГАМК- Т мало изменяется в цитозольной фракции структур гипоталамуса. Наиболее выраженные изменения активности ферментов происходят через 3 часа после введения алкоголя. Такая же картина характерна и для цитозола гипоталамуса, где эта величина возрастает от 66,4±2,4 мкмоль (в норме) до 72,3±2,2 мкмоль. К этому сроку снижение общей активности ГАМК-Т характерно для цитозоль ной фракции гипоталамуса, где она резко возрастает от 69,2±1,6 до 81,6±1,8 мкмоль ГК/г ткани/ч инкубации.У годовалых животных в цитозоле тканей мозга мы обнаружили более выраженные, а в ряде случаях, противоположные изменения ферментативной активности.

Таблица  №3

Изменение количества и активности компонентов глутаминовой метабо лической системы в  гипоталамусе 6-и месячных и 2-х годовалых кроликов самцов после введения этанола в дозе 6 и 8 г/кг массы тела ((М±m)

Показа­тели	Сроки опытов, в ч.	Возраст
		6-и месячный	2-х годовалый
		Структур мозга
		Гипоталамус		Гипоталамус
ГК, мкмоль/г ткани	Контр.	5,3±0,18		5,0±0,14
	1ч	5,0±0,20		5,8±0,22
	Зч	6,3±0,13		6,7±0,19
	Р	<0,05
ГАМК, мкмоль/ч тканей	Контр.	2,1 ±0,06		2,4+0,09
	1ч	1,8±0,08		2,1 ±0,06
	Зч	1,5±0,07		1,6+0,06
	Р			<0,05
гдк, мкмоль ГАМК/г тк. 1 ч инкуб.	Контр.	70,4+2,2		71,3±2,36
	1ч	69,6+3,1		71,9+2,43
	Зч	68,2+4,4		69,7±3,37
	Р
ГАМК-Т,  мкмоль/г мк/ч инкуб.	Контр.	55,8±1,42		73,5±2,29
	1 ч	56,3±2,0		74,3±2,23
	Зч	57,8+3,5		74,9±2,44
	Р	<0,01

 

Установлено, что метаболическая реакция в системе глутаминовой кислоты мозга у более интенсивно растущих 3-х месячных животных, крольчат несколько резкая, чем у 2-х месячных животных. Особенно, интересен факт, ука­зывающий на разнонаправленную изменчивость общей активности ГДК и ГАМК-Т, катализирую щие реакции синтеза ГК и ГАМК. В опытах мы прослеживали реакцию мозга на уровне ГК-ГАМК систем у более взрослых животных – 6-ти месячных, годовалых и 2-х годовалых животных при введении в их организм сравнительно высоких доз алкоголя.

Хроническое введение абсолютного спирта (доза 8г/кг массы тела) в организм 6-ти месячных, годовалых и 2-х годовалых кроликов привело к сильно выраженным изменениям уровня концентрации аминокислотных нейромедиа мозга (табл. 3). При определении в мозге у животных вышеуказанных возрастов содержания ГК и ГАМК через 2 и 3-4 дня было установлено, что алкоголизация животного влеч за собой более стойкие изменения их уровня особенно в нервных центрах гипоталамуса, регулирующих двигательную активность животного. Нами было изучено влияния 40%-ного этанола (доза 8г/кг массы тела) на содержание ГК и ГАМК и активности ГДК и ГАМК в гипоталамусе кроликов разного возраста. Эти опыты показали, что при этом происходит значительное возрастание глутаминовой кислоты.

Таблица  №3

Влияние многократного (7-и дневного, через день) введения этанола (доза 8 г/кг массы тела) на содержание нейромедиаторных аминокислот и активности фермен тов их обмена в тканях гипоталамуса разновозрастных кроликов-самцов (М±m )

Показа­тели	Условие опытов, сроки после введения	6-месячные	годовалые	2-х годовалые
		Структуры мозга
		Гипота­ламус	Гипота­ламус	Гипота­ламус
ГК, мкмоль/г ткани	Норма	5,3±0,18	5,36±0,44	5,0±0,14
	1-й день	4,1±0,30*	4,8±0,19	4,8±0,15
	3-й день	4,0±0,23*	3,7±0,26*	4,3±0,18
гдк, мкмоль ГАМК/г тк/ч инкуба­ции	Норма	70,4±2,2	68,3±2,7	71,3±2,3
	1-й день	72,3±3,8	66,7±З,15	69,0±1,8
	3-й день	72,4±3,3	66,5±2,3	67,5±2,5
ГАМК  мкмоль/г ткани	Норма	2,1±0,06	3,22±0,06	2,1 ±0,06
	1-й день	3.5±0,09*	3,8±0,07	2,8±0,05
	3-й день	3,8±0,07**	4,1±0,15*	3,3±0,09*
ГАМК-Т мкмоль ГК/гтк/ час инку­бации	Норма	55,6±1,42	60,8±2,5	73,5±2,29
	1-й день	53,2±1,8	57,3±1,9	71,0±2,4
	3-й день	51,9±2,3*	54,6±2,2*	68,3±3,7*

Примечание: звездочками (* и **) обозначена р в значениях достоверности <0,05 и 0,01

 

В нашем исследовании животным каждой возрастной группы вводили этанол в дозе 8 г/кг массы тела в течении 7 дней с интервалами в 1 день. Контрольным животным вводили физиологический раствор в таком же количестве. В результате анализов выявлено, что у животных 6-месячного возраста введения значительного количества этанола в 1-й день опыта приводит к снижению содержания нейромедиаторной аминокислоты глутамата, как в ткани сенсомоторной коры, так и в ткани гипоталамуса.

Подитоживая обсуждение полученных экспериментальных данных, их сопоставление с литературными данными, можно констатировать, что этиловый спирт в более сильных дозах, а также его разбавленный (40%-ный) раствор независимо способен вызывать в мозге животного выраженные, в большинстве случаях достоверные изменения в содержании и активности компонентов глутаминовой системы мозга.Касаясь механизма действия алкоголя на ГК-ГАМК системы мозга, отдельные исследователи высказывают мнение, что действие алкоголя на различные функциональные стороны метаболизма в этой системе может быть и ГАМК –ергических нейронов и с помощью молекулярных глутамат и ГАМК – рецепторов, регулирующие различные реакции нервных клеток на нейротропные агенты (1; 2; 3; 6,8).

Таким образом, опыты проведённые на 3-х группах животных разного возраста показали, что в отличие от однократного введения этанола в сравнительно малых до зах (4-6 мг г/кг массы тела), более высокие дозы этого нейротоксического вещества, при его многократном применении, способны вызывать более стойкие изменения в уровне и активности основных компонентов ГК-ГАМК системы мозга. Определение этих показателей в тканях гипоталамуса было обусловлено тем, что физиоло гичес кие и биохимические работы свидетельст вуют, что влечение к алкоголю и развитие нейроадаптивных процессов при алко голизации во многом связано с реактивностью гипоталамических центров.

Выводы:

1. Выявлено, что компоненты системы ГК-ГАМК мозга кроликов проявляют чувствительность к воздействию алкоголя как при однократном, так и при много кратном его введении в относительно больших дозах (от 4 до 6 мл/кг веса тела).

2. Хроническое введение абсолютного спирта (доза 8г/кг массы тела) в организм 6-ти месячных, годовалых и 2-х годовалых кроликов привело к сильно выраженным изменениям уровня концентрации аминокислотных нейромедиаторов мозга.

3. Обнаружены существенные различия в реакциях ГК-ГАМК системы мозга как у 3-х месячных, так и 2-х годовалых самцов и самок кроликов на введения относительно больших доз (6-8 мл/кг массы тела) этилового спирта (40%-ный).

 

ƏDƏBİYYAT - ЛИТЕРАТУРА – REFERENCES:

 

1.Бабич Л.В., Мищук Д.О., Дуденко Н.В. Сравнительные характеристики кратков  ременного и долговременного воздействия этанола на состояние организма крыс // Укр.биохим.ж., 2005, 6, с.73-79.

2.Байдакова Г.В.Алгоритмы дифференциальной диагностики наследственных болезней обмена веществ, сопровождающихся нарушениями метаболизма аминокис лот и ацилкарнитинов: Дисс ... канд. биол. наук. М., 2012, 236 с.

3.Богомолов Д.В. Танатологическая оценка морфологических изменений головного мозга при алкогольной болезни // Нарко логия, 2006, № 11, с.45-47.

4.Ковсан В.М. К определению аминокислотного состава с помощью высоковольтного электрофореза // Укр. биохим. ж. 1969,Т.41, с.601-605

5.Лакин Г.Ф. Биометрия // М., изд-во «Высшая школа», 1990, с. 352-353.

6.Мамедова И.А.Влияние внутриутробной хронической интоксикации этанолом на метаболизм гамк в тканях различных структур центральной нервной системы трех месячных кроликов // Между. научно-исследов-кий журнал, 2016, № 10 (52), с.24-28

7.Осадчая Л. М. Определение активности аминотрансфераз в тканях // В кн.: Методы биохимических исследований. Л., изд-во ЛГУ, 1982, с.246-250  

8.Рослый И.М. Биохимия и алкоголизм:типовые клинико-биохимические синдромы при хронической алкогольной интоксикации //Вопр. наркол.  2004, № 5, с. 46-56

9.Lowry R.H., RossebraughN.J., FarrA.L. RandallR.L. Protein measurement with the folinphenolreagent // J. Biol. Chem., 1951, 1, p. 365-273.

10.Meir K., Galante M., Angula M., Audinat E. Tonic activation of NMDA receptors by ambient glutamate of non-synaptic origin in rat hyppocampus // The Jornal of Physiology, 2007, 2, p. 373-385.