SAĞLAMLIQ

HELİKOBAKTERİOZUN DİAQNOSTİKASINDA MİKROSİSTEMƏ ƏSASLANAN YENİ İSTİQAMƏT.

08-10-2018

Açar sözlər: H. pylori, mikrokultivasiya, PCR, kultivasiya, CLO test, histopatoloji.

Helicobacter pylori (H.pylori) 1982-ci ildə Marshall və Warren tərəfindən təsbit edilmişdir, mədə xorası xəstəliyinin distal mədə karsinoması və mədənin selikli qişası ilə əlaqəli toxuma limfomasının  mühüm rol oynayır.

H.pylori infeksiyasının xroniki övrə kimi bəzi ekstradiqestiv və dermatoloji təzahürləri də vardır(1). Dünya əhalisinin demək olar ki, yarısının H.pylori ilə yoluxduğu və infeksiya tezliyi artdığına görə, uşaq yaşlarıda yoluxma tezliyi 0-5 yaş uşaqlar üçün 10-20% təşkil edir və yetkinlərdə 30-50% artır (2).

H. pylori, infeksiyanın aradan qaldırılması, antibiotiklərə davamlı ştamların artması, qızıl standart kimi bir diaqnostik metodun olmaması və əldə edilən vaksinlərin təsirsiz olması səbəbindən bu problem aktual olaraq qalır. Bundan əlavə, H.pylori infeksiyasının əsas ocağı təkcə mədə olması haqda da ədəbiyyatda hələ  fikir birliyi yoxdur. Bakteriyaların diş ərpində və ağız boşluğunda kolonizə etmək qabiliyyəti haqda informasiyalar verilir. Eyni zamanda bu bakteriyanın maddələr mübadiləsini pozmaqla, ÜİX-ləri və digər xəstəliklərə səbəb ola bilməsi haqda da müxtəlif məlumatlar verilir.

H.pylori üçün histopatoloji müayinəsi (HM), sürətli ureaza (CLO) testi və klassik kultivasiya (KK) və seroloji, 13C-ureaza nəfəs testi kimi qeyri invaziv metodlar var, lakin klinik diaqnostika üçün bir neçə invaziv üsullar da var[3,4,5]. Bu metodlardan, xəstələrdən alınan mədə biopsiyalarından H.pylori–nin əkilməsi ən spesifik və ən həssasıdır. Lakin, H.pylori-nin kultivasiyası xüsusi bir qidalı mühit və xüsusi atmosfer şəraitini tələb edir, bu da onun diaqnostik metod kimi rutin olaraq istifadəsinə mane olur. Halbuki, mədənin cismi və antrumdan alınan nümunələrdə H.pylori-nin histopatoloji aşkarlanması həm CLO testindən, həm də KK-dən daha həssas bir üsul olduğu bildirilmişdir[6]. Lakin, histopatoloji aşkarlanması nümunələrin dəqiq müayinəsi üçün mütəxəssis pataloq tələb edir və eyni zamanda hansı növün dəqiq təyini də mümkün deyil.

CLO testi, sürətli, ekonomik və 90%-dən çox spesifikliyə malik olmasına baxmayaraq, bu üsul aktual qanayan xora və bağırsaq metaplasiyasına malik hallarda və xəstələrdə proton pompası inhibitoru (PPİ) ilə müalicə alınan zaman mənfi nəticələrə səbəb olur. Bundan əlavə, bu üsul nümunədə ureaza pozitiv bakteriyalar mövcud olduqda da yalançı müsbət nəticələr verə bilər. Bu səbəblərə görə, CLO testində həssaslıq aşağı olur [7,8,9]. 13C-ureaza nəfəs testi böyük insanlar üçün yüksək həssaslıq göstərsə də, xəstəliyin ilkin mərhələsində və uşaqlar üçün həssaslıq aşağı olur. Əlavə olaraq, qaz xromatoqrafiyası və kütləvi spektroskopiya istifadəsi tələb olunur ki, bu da onun dəyərini artırır. Anticisim aşkarlanmasına əsaslanan seroloji testlər 85% həssaslığa və 80% spesifikliyə malikdir, lakin müalicənin təqibi üçün qeyri-kafi hesab olunur [4,5,6,1].

Müalicədən əvvəl və sonra, antigenin aşkarlanması üçün praktiki bir seroloji üsul olan H.pylori antigen testi PPİ dərmanları və bizmut törəmələri istifadə edən xəstələr üçün yalançı mənfi nəticələrə məruz qalma riskini artırır [5,9]. H.pylori diaqnozu üçün bir neçə invaziv və qeyri-invaziv metodun olmasına baxmayaraq, bunlardan heç biri qızıl standart kimi qəbul edilməmişdir [2,10].

H.pylori-nin diaqnozu və müalicəsi üçün əsas hədəf xəstələrin müalicə olunduğu zaman, antibiotik müalicəsinə qarşı rezistent bakteriya kulturasının inkişafını təqib etmək, beləki, bu həm müalicəyə cavab verməmək probleminin həlli üçün, həm də xəstəliklərin ağırlaşmalarının qarşısının alınması üçün vacibdir. 

H.pylori antimikrob resistentliyi araşdırmaq üçün müşahidə işləri bakteriyaların izolyasiyası ilə həyata keçirilə bilər[11]. Halbuki, mövcud kultivasiya üsullarının mənfi cəhətləri bu tip tədqiqatların asanlıqla yerinə yetirilməsinə imkan vermir [8,2]. Bu kimi problemlərə görə, yeni metodların inkişaf etdirilməsi və ümumi üsulların optimallaşdırılması vacibdir, beləliklə, onlar bu mənfi cəhətlərdən azad olmalıdırlar.

Tədqiqatlarda, mikroaerofil mikroorqanizm Leishmania promastigot parazit sayından asılı olmayan mikrokapilyar kultivasiya metodu (MKM) tərəfindən sürətlə inkişaf etdirildiyi bildirilir[18,19]. Bu metod kiçik bir sıra nümunələrin bir hematokrit kapilyarına və bu şəraitdə sürətlə böyüdülmüş mikroaerofil mikroorqanizmlərin aşkarlanması ilə bağlıdır. Mikroskopdan istifadə edərək, bu mikroorqanizmlərin xüsusi hərəkətlilik xüsusiyyətləri müşahidə edilir [12, 13]. Hal-hazırda, MKM əsasən Leishmaniozun diaqnozu üçün istifadə olunur və bu metod ənənəvi kultivasiya üsullarından daha dəqiq, həssas və iqtisadi cəhətdən ekonomik olduğu aşkar edilmişdir.

MKM, H.pylori-nin sağ qalması üçün vacib olan mikroaerofil şəraitdə kultivasiya edildiyindən, bu üsuldan, H.pylori-nin təyini və yetərli inkişafı üçün də istifadə edilə biləcəyinə əminlik yaranır. Bundan başqa, bakteriyaların MKM vasitəsilə böyüməsi yalnız az miqdarda bakteriyanı əhatə edən və H.pylori – nin əkilməsi üçün selektiv maddələrin istifadəsindən yaranan, çirklənmə risklərini azalda biləcək, nümunələrdə bu mikroorqanizmlərin aşkarlanmasına imkan verə bilər. Lakin, H.pylori-nin MKM vasitəsilə böyüməsini əks etdirən ədəbiyyatda heç bir tədqiqat yoxdur. Buna görə konsepsiyanın bir sübutu olaraq, ilk dəfə H.pylori diaqnozu və izolyasiyasında MKM-nun effektivliyini tədqiq edirik və klassik kultivasiya, histopatologiya və sürətli ureaza testləri ilə diaqnostik dəyərləndirməni müqayisə edirik.

Material və metodlar.  MKM istifadəsi H.pylori-nin çoxalması üçün nəzərdə tutulmuş diaqnostik test olaraq endoskopiya göstəricisi olan dispeptik xəstələrlə aparılıb. Bu xəstələr ATU – nun Onkoloji Xəstəxanasında endoskopiya şöbəsində aparılan seçilmiş 20 xəstə (12 kişi və 8 qadın, ortalama yaş = 53.4 il ) daxil edildi. Xəstə və kontrol qrupları etirazları olmayan, müayinədən keşmək üçün məmnun qalan iştirakçılardan ibarət idi: H.pylori ilə infektə olmayan; mədədə cərrahiyyə problemi olmayan; son iki həftə ərzində H.pylori eradikasiya müalicəsi, antibiotik və ya PPİ(proton pomb inhibitorları) preparatlarnı qəbul etməmiş; bizmut duzlarını qəbul etməmiş; qanaxma və pıxtılaşma problemləri olmayan insanlar seçilmişlər. Xəstə qrupu, histopatoloji və sürətli ureaza testi və / və ya KK kimi ən azı iki diaqnostik test tərəfindən pozitiv biyopsi nümunələrinin müsbət olduğu xəstələrdən ibarət idi. Biyopsiya nümunələri H.pylori üçün histopatoloji və sürətli üreaza testi və / və ya KK ilə pozitiv olan xəstələrdən ibarət idi.

Nümunə toplama. Xəstələrdən antrum və corpus nahiyələrindən, üç bioptat alınmışdır, bunlardan biri patoloji laboratoriyasına göndərilmişdir. Qalan iki biopsiya dərhal qlükoza ilə 20% brucella bulyonu olan borulara yerləşdirilib laboratoriyaya gətirilirdi. Referans Klinik Laboratoriyasına biopsiya materialı KK və sürətli ureaza testləri ilə reallaşdırıldı. Digər biyopsiya nümunələri, mikrokapilyar kultivasiya üçün istifadə edilmişdir. Kultivasiya üsulu laboratoriyada müstəqil olaraq həyata keçirilmişdir və nəticələr invert mikroskop tərəfindən təyin olunmuşdur. Toplanmış nümunələrin diaqnostikası bir neçə metodla aparılmışdır. 

        Klassik kultivasiya metodu(KK). Klassik kultivasiya metodu, Referans klinik laboratoriya mərkəzinin mikrobioloji laboratoriyasında həyata keçirildi. 20% glyukoza malik olan 500 μL brucella bulyonu (Biolife) olan sınaq şüşələrinin içərisində qoyulan biopsiya materialları laminarda şüşə çubuq ilə homogenləşdirilmişdir. Bu homojenləşdirilmiş nümunənin üç və ya dörd tikəsi H.pylori izolyasiyası üçün Kolumbiya ağarına, 10% defibrlənmiş at qana, 10 mq / l-yə qədər olan, istifadəyə hazır selektiv mühitdə (Becton Dickinson, Helicobacter Agar, Modified) inokulyasiya (L vancomycin, 10 mg / L amfotericin B, 5 mg / L sefsulodin və 5 mg / L trimetroprim və 37 ℃ ilə) edilib və inkubasiya edilmişdir. Mikroaerofil mühit CampyGen (BD GasPack) tərəfindən təmin edilmişdir. 72 saatlıq inkubasiya dövründən sonra bakteriyaların koloniyasına görə, morfologiyası və onların Qram boyama xüsusiyyətləri öyrənilmişdir. H.pylori katalaza müsbət, ureaza və oksidaza aktivliyi olan, yarım şəffaf, 1-2 mm diametrli koloniyalar qiymətləndirilmişdir. Bu koloniyaların bir hissəsi 20% gliserol təşkil edən brucella bulyonu içində inokulə edilir və -80 ℃ saxlanılmışdır [1,2].

Mikrokultivasiya metodu(MKM). Mikrokapilyar kultivasiya sistemindən istifadə üçün mikrokapilyar borular (ISOLAB), öncədən 1 saatlıq kalium xromat məhlulunda saxlanılır, sonra təmiz su ilə yuyulur. Sonra onlar 180° C-da 1 saatlıq Paster sobasında sterilizasiya edilir. Biopsiya materialları, 20% glyukozaya malik 500 μL brusella bulyonu (Biolife) olan sınaq şüşələrində, KK-də istifadə edildiyi kimi eyni üsulla homogenləşdirilir. Hər bir mikrokapilyar boruda homojenləşdirilmiş nümunənin 60 μL götürülür və boruların ucları steril silikonla bağlanılır. Mikrokapilyar borular, 37℃ 48 saat inkubə edilir və heç bir CO₂ paketlərindən istifadə edilmir. İnkubasiya dövründən sonra üç kapilyar boruların sonu steril şəraitdə laminarda sınıb və tərkibində H.pylori üçün selektiv qidalı mühitə (Becton Dickinson, Helicobacter Agar, Kolumbiya ağzını, 10% defibrinli at qanı, 10 mg / L vancomycin, 10 mg / L amfotericin B, 5 mg / L sefsulodin və 5 mg / L trimetroprimini) əkilir. Media, CampyGen tərəfindən təmin edilən bir mikroaerofil şərait yaradılaraq, 37 ℃ ilə inkubasiya edilir. İnkubasiya dövründən sonra, müsbət katalaza, ureaza və oksidaza aktivliyi müsbət olan, yarım şəffaf, 1-2 diametrli koloniyalar H.pylori kimi qiymətləndirilmişdir. Bundan əlavə, bu kulturaların DNT-si zəncirvari polimeraza reaksiya (PCR) istifadə edilməklə təsdiq edilir.

İnvert mikroskopiya metodu. 48 saatlıq inkubasiya dövründən sonra homogenləşdirilmiş biyopsiya materialları olan mikrokapilyar borular inkubatordan çıxarılıb və səthləri quru kətan ilə təmizlənir. Mikrokapilyar borular bir – bir mikroskop masasına yerləşdirilib, borunun səthi 10 okulyar və 10x obyektivdən istifadə edilərək tapılır. Sonra H.pylori–ni tədqiq etmək məqsədilə 20×və 40× obyektivlərə çevirərək baxılır. H.pylori–yə xarakterik hərəkəti ilə spiral formasına mikroorqanizmlər H. pylori kimi şərh edilmişdir.

Molekulyar genetik üsul ZPR(PCR). MKM tərəfindən təcrid olunmuş H.pylori təmiz kulturası PCR tərəfindən təsdiq edilmişdir. DNT-nin izolyasiyası üçün şəffaf koloniyalar (diametri 1-2 mm) 1 mL PBS olan 1.5 mL Eppendorf tüblərində toplanılır. Eppendorflar 3000 qr 15 dəqiqə sentrifuqada fırladılır. DNT hasilatı, istehsalçının göstərişinə əsasən, yüksək saf PCR şablon hazırlıq dəsti (Roche Diagnostics GmBH, Almaniya) ilə aparılmışdır. H.pylori-nin 110 bp 16srRNA gen bölgəsinə aid olan Hp1 (İrəli; 5'CTG GAG AGA CTA AGC CCT CC3 ') və Hp2 (Reverse; 5'ATT ACT GAC GCT GAT TGT GC3') primerləri T100 termik sikllərlə həyata keçirilmişdir (Biorad, Amerika Birləşmiş Ştatları) [20]. PCR tərkibi istehsalçının göstərişinə əsasən PCR Master Mix dəsti (Fermentas, ThermoFisher Scientific, Amerika Birləşmiş Ştatları) ilə hazırlanmışdır. Cəmi 50 μL reaksiya həcmində, 25 μL PCR Master Mix, 3 μL ilkin primer, 3 μL revers primer, 5 μL izolyasiya edilmiş DNT və 14 μL PCR dərəcəli su istifadə edilmişdir. Amplifikasiya protokolunun reaksiyası 3 dəqiqə üçün 95 ℃ dövr olaraq, 1 dəqiqə üçün 60 ℃ 38 dövr və 30 s üçün 95 ℃; 72 ℃ bir döngə 3 dəq olmuşdur. Elektroforez üçün 2% agarozalı gel 0.6 qram agaroza, 2 mL bromid etidium və 30 mL TAE tamponu (40 mmol / L Tris-asetat, 1 mmol / L EDTA, pH 8.0) ilə hazırlanmışdır. 1 μL 6 × Yükləmə Boya (Fermentlər) və 5 μL amplikon hər quyuya yüklənir. Bundan əlavə, 1 ml 100 bp DNT, müsbət və mənfi kontrollar uyğun quyuda yüklənmişdir. Sonra gel 55 mA və 110 V-də 20 dəqiqəliklə qoşalaşmışdır. UV-monitor geli Doc EZ System (Biorad, Amerika Birləşmiş Ştatları) bantları göstərilir. Müsbət kontrol olan 110 bp bandına bənzər bantlar müsbət olaraq qəbul edilir.

Statistik analiz. Data SPSS 15.0 statistik proqramı (Sosial Elmlər üçün statistik paketlər, SPSS Inc, Chicago) ilə təhlil edilmişdir. Metodların diaqnostik performansı spesifiklik, həssaslıq, PPV, NPV və 95% CI(uyğunluq koofisienti) ilə hesablanmışdır.

Alınmış nəticələr və onların müzakirəsi. 20 xəstənin antrum və corpus nahiyələrindən əldə edilmiş biyopsiya nümunələrində H.pylori CLO test + HM və / və ya KK üsulları ilə müsbət nəticələr əldə edildi. 19 (19/20) xəstə biopsiyası nümunəsində H.pylori MKM tərəfindən izolə olunmuşdur, buna baxmayaraq yalnız 11 (11/20) xəstə biopsiyası nümunəsində H.pylori KK tərəfindən təcrid olunmuşdur. 13 (13/20) xəstə biopsiyası nümunəsində CLO testi və HM pozitif tapıldı.

20 xəstənin biopsiya nümunəsində H.pylori MKM vasitəsilə təcrid olunmuşdur, onlardan yalnız 13 (13/20) H.pylori CLO testi ilə HM və yalnız 11 (11/20) xəstə biopsiyası nümunəsində H.pylori KK tərəfindən təcrid olunmuşdur. MKM tərəfindən təcrid olunmuş H.pylori varlığı ən azı bir üsulla təsdiqlənmişdir (Cədvəl 1). MKM, KK, CLO testi və HM tərəfindən H.pylori izolyasiyasının nəticələrinin müqayisəsi ilə MKM həssaslığı 96%, spesifiklik 80%, PPV 83%, NPV nisbətən 95% olduğu halda, uyğunlaşma əmsalı 0,67 (χ 2 = 31,51, P <0,01) kimi tapılmışdır (Cədvəl 2).

11 (11/20) xəstə biyopsiya nümunəsində KK tərəfindən H.pylori –nin təmiz kulturası əldə edilmişdir. Onlardan 7-u (7/11) MKM tərəfindən müsbət tapıldı və onlardan 4-ü (4/11) MKM, CLO testi və HM tərəfindən pozitiv tapıldı. KK-nin həssaslığı 54%, spesifiklik 100%, PPV 100%, NPV 68%, razılaşma ĸ katsayısı isə 0.54 (χ2 = 19.15 , P <0.01) (Cədvəl 2).

H.pylori CLO testi ilə müsbət tapıldı və HE 13 xəstə biopsiyası nümunəsində 13/20 təsbit edildi. Onlardan 8-i (8/13) H.pylori MKM tərəfindən izolə olunmuşdur və onlardan 4 (4/13)  də H.pylori həm MKM, həm də KK tərəfindən izolyasiya olunmuşdur. Bir xəstə biopsiyası nümunələrində H.pylori MKM və KK tərəfindən təcrid olunmadı; yalnız CLO testi və HM tərəfindən müəyyən edilmişdir. CLO testinin həssaslığı və HM% 65, xüsusilik 100%, PPV 100%, NPV 74%, uyğunluq əmsalı 0,64 (χ 2 = 25.26, P <0.01) 

Сədvəl  № 1.

Biyopsiya materiallarında, müxtəlif diaqnostik üsullarla H.pylori izolyasiyasının nəticələri.

KK: klassik kultivasiya; HM: Histopatoloji müayinə; CLO: Rapid ureaza testi; MKM: Mikrokapilyar kultivasiya metodu.

Biopsiya	KK	MKM	HM	CLO
11	+	+	+	++
2	+	+	-	-
3	-	+	+	+
4	-	+	+	+
5	+	+	-	-
6	+	+	+	+
7	-	+	+	+
8	-	+	+	+
9	+	+	-	-
10	-	+	+	+
11	+	+	-	-
12	-	+	+	+
13	+	+	+	+
14	+	+	+	+
15	-	+	+	+
16	-	+	+	+
17	+	+	+	+
18	+	+	-	-
19	-	+	+	+
20	+	-	-	-

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

20 xəstənin biopsiya materiallarında H.pylori MKM ilə izolə olunmuşdur.  MKM, KK, CLO testi və HM ilə H.pylori –nin izolyasiyasının nəticələrini müqayisə edərək, MKM həssaslığı 96%, spesifiklik 80%, PPV 83%, NPV 95% və 95% CI kimi 0.76 (χ 2 = 31.51, P <0.01), KK isə həssaslığı 54% (χ 2 = 19.15, P <0.01), CLO testinin həssaslığı və HM 65% olaraq (χ 2 = 25.26, P <0.01). (Cədvəl 2). Nəticə olaraq deyə bilərik ki, H.pylori üçün yeni mikrokapillar kultivasiya üsulu KK, HM və CLO testlərinə nisbətən yüksək diaqnostik həssaslığa malikdir.

Сədvəl  № 2.

MKM diaqnostik göstəriciləri, klassik kultivasiya, histopatoloji müayinəsi və sürətli ureza testi

 

	H.pylori (+) pozitiv	H.pylori (-) neqativ
MKM
+	19	4
-	1	16
TOTAL	20	20
KK
+	11	-
-	9	26
TOTAL	20	26
HM və CLO test
+	13	-
-	7	20
TOTAL	20	20

H. pylori, Mikrokapilyar kultivasiya metodunun diaqnostik göstəriciləri (MKM): Həssaslıq: 96%, spesifiklik: 80%, müsbət proqnozlaşdırma dəyəri (PPV): 83%, mənfi proqnozlaşdırma dəyəri (NPV): 95%, kappa: 0.76;

Klassik kultivasiya üsulunun diagnostik dəyərləri,  Həssaslıq: 54%, spesifiklik: 100%, PPV: 100%, NPV: 68%, kappa: 0.54;

HM histopatoloji metod; həssaslığı: 65%, spesifiklik: 100%, PPV: 100%, NPV: 74%, kappa: 0.64; CLO (Sürətli üreaza) testinin diaqnostik göstəriciləri: Həssaslıq: 65%, spesifikliyi: 100%, PPV: 100%, NPV: 74%, kappa: 0.64.Müzakirə.İnvaziv və qeyri-invaziv testlər qastrit, onikibarmaq bağırsaq xorası, MALT limfoma və mədə karinomasının patologiyalarında rol oynayan H.pylori–nin in vitro diaqnostikasında istifadə edilə bilər [8,15,14]. Diaqnostik test kimi KK tərəfindən mədə toxumalarından bakteriyaların izolyasiya olunması onun aşağı həssaslığı səbəbindən problemlidir [14].

KK üsulunda, inkubasiya şəraiti, qidalı mühitin tərkib hissəsinin optimallaşdırılması və biyopsiya nümunəsinə aid olan çirklənmə məsələləri əsas problemlər kimi istinad edilə bilər [8,14]. Mədə toxumasından KK üsulu ilə H.pylori-nin izolyasiyası bir metod kimi qəbul edilməsinə baxmayaraq, Maastrix kriteriyalarına görə, bakteriyaların gec köçürülməsi və metodun aşağı diaqnostik həssaslığı kimi amillərə görə, diaqnoz qoymaq üçün rutin olaraq istifadə edilməmişdir [14].

KK üsulunda çətinliklər olmasına baxmayaraq, canlı və aktiv H.pylori-nin təmiz kulturası EPIYA-mədə karsinoması üçün tədqiqatı, nümunələrin antimikrob rezistentliyinin müəyyən edilməsi və yeni müalicə variantlarının təklifi daxil olmaqla, bir sıra mühüm tədqiqat işləri üçün bir tələbdir. Bütün bunlar kultivasiya metodunun əhəmiyyətini vurğulayır [11].

H.pylori-nin izolyasiyasının əhəmiyyətini nəzərə alaraq hələ də alternativ izolyasiya metodlarının axtarışı da davam edir. Bu tədqiqatda, dünyada ilk dəfə olaraq MKM H.pylori-nin diaqnozu üçün istifadə edilmiş və onun diaqnostik dəyərləri KK, HM və CLO testinə görə qiymətləndirilmişdir. MKM-in diaqnostik həssaslığını 96%-ə, 80% spesifikliyi ilə təyin edildi. PPV 83%, NPV 95%, uyğunluq nisbəti korrelyasiya əmsalı 0.76 oldu. Bu nəticələrə görə MKM-in həssaslığı KK(54%), HM və CLO testlərindən (65%) daha yüksək təyin edildi. Əksinə, MKM-nin spesifikliyi (80%) isə KK-dan (100%) aşağı müəyyən edildi. KK-nin həssaslığına bir çox faktorlar; bakteriyaların sıxlığı, çirklənmə, atmosfer təsiri, antibiotiklərin və ya PPİ-ların və qidalı mühitin tərkib hissəsi təsir göstərir [8,14]. Çalışmamızda, KK-nin diaqnostik həssaslığı bu faktorlardan asılı olaraq aşağı olması ehtimal edilir. Bunun əksinə, MKM zamanı isə bu faktorların qarşısının alınması və əlavə olaraq, mikroaerofil mühitə uyğunlaşmasını asanlaşdırmaqla bakteriyaların çoxalmasını artıran daha uyğun bir şəraiti təmin etdiyi aşkar edilmişdir.

İlk dəfə mikrokultivasiya üsulundan Leishmania parazitlərinin çoxalması üçün istifadə edilmişdir. Bu metodun köməkliyi ilə, yüksək parazit yükü orta səviyyədə autokrinin konsentrasiyasının artırmasına nail olunub. Biz inanırıq ki, MKM-nin üstün xüsusiyyətləri H.pylori –nin artımasına da kömək olaraq effektiv üsul olacaq. Blakemore [16] və Wolfe et al. [17] tədqiqatlarına görə bir çox mikroaerofil bakteriyaların (adlandırılmış maqnetik bakteriyalar) mikrokapilyar borularda konsentrasiyasının dəyişməsini təyin etdilər ki, bu da hüceyrədaxili dəmir hissəciklərinin maqnit qüvvələri hesabına, xemotaksisə səbəb olduğu üçün baş verir. Mikrokapilyar borularda H.pylori inkişafına oxşar amillər ehtimal olunur.

CLO testinin 7 (11) halda pozitiv və KK isə neqativ tapılması, MKM-nin yüksək diaqnostik həssaslığının artmasını təsdiqləyir. Beləliklə, ehtimal edilə bilər ki, bu toxuma nümunələri MKM üsulu vasitəsilə H.pylori müsbət tapıldığı və HM və CLO testinləri də pozitiv olmasına baxmayaraq, H.pylori, bakteriyaların aşağı sıxlığı səbəbindən KK-də mənfi olub. MKM-nin diaqnostik həssaslığı yüksək olsa da, spesifiklik KK ilə müqayisədə daha aşağı idi. Nəzarət qrupunun beşində H.pylori MKM tərəfindən müsbət tapıldı; qeyd etmək lazımdır ki, bu hallarda müsbət nəticələr də PCR metodu ilə müəyyən edilmişdir. Maastrix diaqnostik referens metodlarına görə, yalançı H.pylori neqativ kimi qiymətləndirilən nəticələrə əsasən biopsiya nümunələrinin diaqnozu üçün molekulyar üsulların tətbiqi hələ tam optimallaşdırılmamışdır. Bununla yanaşı, bu nəticələr dispeptik şikayətləri olan xəstələrə və H.pylori mənfi hallarda, referans metodları ilə diaqnoz olunmuş xəstələrdə gələcək tədqiqatların aparılmasında faydalı ola biləcəyini göstərir.

Bu araşdırmadan digər bir maraqlı müşahidələrdən biri də, 9 xəstədə HM neqativ cavab əldə edildiyi halda, H.pylori-nin KK və MKM tərəfindən izolyasiya edilə biləcəyini göstərdi. Bəzi məlumatlar, biopsiya bölgəsinin düzgün seçilməməsi, toxumada bakteriyaların qeyri-homogen yayılması, bakteriyanın miqdar azlığı və ya biopsiya tikəsində H.pylori-nin çox aşağı kontrastlı fərqlərin olması səbəbindən yanlış mənfi histopatoloji nəticələrə səbəb olur [14]. Bu nümunələrdə H.pylori-nin izolyasiyası, metodun diaqnostik göstəricisini artırdı. H.pylori ilə əlaqəli qastritin diaqnozu üçün istifadə olunan CLO testi bir neçə səbəbdən yanlış pozitif nəticələrə səbəb ola bilər: (1) digər ureaza fermenti istehsal edən bakteriyalarla çirklənmə; (2) endoskopiya zamanı CLO testinin düzgün tətbiq edilməməsi; (3) antibiotiklərə və PPİ-larının istifadəsinə görə bakteriyaların müvəqqəti azalması; (4) uyğun olmayan biopsiya bölgəsi [14]. Buna görə də, CLO testi tək istifadə edildikdə, aşağı diaqnostik dəyəri var. Lee və digərləri [14] 2013-cü ildə antrum və ya corpus nümunələri ilə aparılan CLO testinin həssaslığının 60-65% olduğunu təsbit etdilər. Test, antrum və corpus hissələrndən götürülən nümunələrdən birlikdə həyata keçirildikdə isə, KK metodu üçün (91%) olduğu haldan aşağı olsa da, həssaslıq 85% -ə çatdı. Burada CLO testi 13(17) corpus və antrum nümunələrində müsbət tapıldı. H.pylori KK və ya MKM tərəfindən 7 nümunədə izolyasiya olduğu halda, CLO test nəticəsinin mənfi oldu. Beləliklə, MKM-nin H.pylori–nin laborator diaqnostikasında həssaslıq baxımından CLO testindən üstün olduğunu gördük.

Nəticədə, tədqiqatlar göstərir ki, H.pylori üçün yeni bir mikrokultivasiya metodu KK, HM və CLO testləri ilə müqayisədə yüksək diaqnostik həssaslıq baxımından üstündür və metod özü də mikroaerofil şəraiti təmin edir; həm də inkubatorlarda çox kiçik bir yer tutma xüsusiyyətinə malikdir. H.pylori-yə diaqnoz qoymaq üçün bu yeni kultivasiya üsulunun rutin olaraq istifadəsini təşviq etməməzdən öncə, xəstələrin dispeptik şikayətlərli nəzərə alınmaqla digər halların tədqiqatlarına ehtiyac duyulur.

              

ƏDƏBİYYAT - ЛИТЕРАТУРА– REFERENCES:

1.  McColl KE. Clinical practice. Helicobacter pylori infection. N Engl J Med 2010; 362: 1597-1604 [PMID: 20427808 DOI: 10.1056/NEJMcp1001110]

2.  Frenck RW, Fathy HM, Sherif M, Mohran Z, El Mohammedy H, Francis W, Rockabrand D, Mounir BI, Rozmajzl P, Frierson HF. Sensitivity and specificity of various tests for the diagnosis of Helicobacter pylori in Egyptian children. Pediatrics 2006; 118: e1195-e1202 [PMID: 16982805 DOI: 10.1542/peds.2005-2925]

3. Guarner J, Kalach N, Elitsur Y, Koletzko S. Helicobacter pylori diagnostic tests in children: review of the literature from 1999 to 2009. Eur J Pediatr 2010; 169: 15-25 [PMID: 19618211 DOI: 10.1007/s00431-009-1033-x]

4. Erzin Y, Altun S, Dobrucali A, Aslan M, Erdamar S, Dirican A, Kocazeybek B. Evaluation of two enzyme immunoassays for detecting Helicobacter pylori in stool specimens of dyspeptic

patients after eradication therapy. J Med Microbiol 2005; 54: 863-866 [PMID: 16091438 DOI: 10.1099/jmm.0.45914-0]

5. Erzin Y, Altun S, Dobrucali A, Aslan M, Erdamar S, Dirican A, Kocazeybek B. Comparison of two different stool antigen tests for the primary diagnosis of Helicobacter pylori infection in Turkish patients with dyspepsia. Helicobacter 2004; 9: 657-662 [PMID: 15610080 DOI: 10.1111/j.1083-4389.2004.00280.x]

6. Tian XY, Zhu H, Zhao J, She Q, Zhang GX. Diagnostic performance of urea breath test, rapid urea test, and histology for Helicobacter pylori infection in patients with partial gastrectomy: a meta-analysis. J Clin Gastroenterol 2012; 46: 285-292 [PMID: 22392025 DOI: 10.1097/MCG.0b013e318249c4cd]

7. Malfertheiner P, Megraud F, O’Morain CA, Atherton J, Axon AT, Bazzoli F, Gensini GF, Gisbert JP, Graham DY, Rokkas T, El-Omar EM, Kuipers EJ. Management of Helicobacter pylori infection—the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut 2012; 61: 646-664

[PMID: 22491499 DOI: 10.1136/gutjnl-2012-302084]

8. Choi YJ, Kim N, Lim J, Jo SY, Shin CM, Lee HS, Lee SH, Park YS, Hwang JH, Kim JW, Jeong SH, Lee DH, Jung HC. Accuracy of diagnostic tests for Helicobacter pylori in patients with peptic ulcer bleeding. Helicobacter 2012; 17: 77-85 [PMID: 22404437 DOI: 10.1111/j.1523-5378.2011.00915.x]

9. Tsuchiya M, Imamura L, Park JB, Kobashi K. Helicobacter pylori urease inhibition by rabeprazole, a proton pump inhibitor. Biol Pharm Bull 1995; 18: 1053-1056 [PMID: 8535394]

10. Koletzko S, Jones NL, Goodman KJ, Gold B, Rowland M, Cadranel S, Chong S, Colletti RB, Casswall T, Elitsur Y, Guarner J, Kalach N, Madrazo A, Megraud F, Oderda G. Evidence-based guidelines from ESPGHAN and NASPGHAN for Helicobacter pylori infection in

children. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2011; 53: 230-243 [PMID: 21558964 DOI: 10.1097/MPG.0b013e3182227e90]

11 Megraud F, Coenen S, Versporten A, Kist M, Lopez-Brea M, Hirschl AM, Andersen LP, Goossens H, Glupczynski Y. Helicobacter pylori resistance to antibiotics in Europe and its

relationship to antibiotic consumption. Gut 2013; 62: 34-42 [PMID: 22580412 DOI: 10.1136/gutjnl-2012-302254]

12 Allahverdiyev AM, Uzun S, Bagirova M, Durdu M, Memisoglu HR. A sensitive new microculture method for diagnosis of cutaneous leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg 2004; 70: 294-297 [PMID: 15031519]

13. Allahverdiyev AM, Bagirova M, Uzun S, Alabaz D, Aksaray N, Kocabas E, Koksal F. The value of a new microculture method for diagnosis of visceral leishmaniasis by using bone marrow and peripheral blood. Am J Trop Med Hyg 2005; 73: 276-280 [PMID: 16103589]

14. Lee HC, Huang TC, Lin CL, Chen KY, Wang CK, Wu DC. Performance of Routine Helicobacter pylori Invasive Tests in Patients with Dyspepsia. Gastroenterol Res Pract 2013; 2013: 184806 [PMID: 24454337 DOI: 10.1155/2013/184806]

15 Saribas S, Kocazeybek B, Aslan M, Altun S, Seyhun Y, Oner YA, Memisoglu N. Do procalcitonin and C-reactive protein levels have a place in the diagnosis and follow-up of Helicobacter pylori infections? J Med Microbiol 2004; 53: 639-644 [PMID: 15184535

DOI: 10.1099/jmm.0.05398-0]

16. Blakemore RP. Magnetotactic bacteria. Annu Rev Microbiol 1982; 36: 217-238 [PMID: 6128956 DOI: 10.1146/annurev.mi.36.100182.001245]

17. Wolfe RS, Thauer RK, Pfennig N. A “capillary racetrack” method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiol Lett 1987; 45: 31-35 [DOI: 10.1016/0378-1097(87)90039-5]

18.Goodwin CS, Mendall MM, Northfield TC. Helicobacter pylori infection. Lancet 1997; 349: 265-269 [PMID: 9014926 DOI: 10.1016/S0140-6736(96)07023-7]

19. Enroth H, Engstrand L. Immunomagnetic separation and PCR for detection of Helicobacter pylori in water and stool specimens. J Clin Microbiol 1995; 33: 2162-2165 [PMID: 7559969]