РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕНОВ II КЛАССА ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ У ЖЕНЩИН С РАЗЛИЧНЫМИ ОСЛОЖНЕНИЯМИ БЕРЕМЕННОСТИ В АНАМНЕЗЕ

08-05-2009

На связь антигенов главного комплекса гистосовместимости (HLA) и репродуктивные проблемы было обращено внимание исследователей ещё в 80-е годы прошлого столетия [3,4]. Целый ряд работ был посвящен изучению совпадений по HLA-антигенам среди пар с необъяснимым бесплодием [2,3]. В 90-х годах группа датских исследователей во главе с Christiansen O.B. нашла взаимосвязь антигенов HLA класса II c репродуктивными потерями у женщин [8,9]. С тех пор продолжается накопление фактов о роли HLA в процессах репродукции.

Несовместимость супругов по HLA-антигенам и отличие зародыша от материнского организма является важным моментом, необходимым для сохранения и вынашивания беременности, а также риска развития врожденных пороков. Сходство супругов по антигенам тканевой совместимости приводит к "похожести" зародыша на организм матери, что становится причиной недостаточной антигенной стимуляции иммунной системы женщины, и необходимые для сохранения беременности реакции не запускаются. При нормальном развитии беременности "блокирующие" антитела к отцовским антигенам появляются с самых ранних сроков беременности. Причем, самыми ранними являются антитела к антигенам II класса гистосовместимости [4,11].

Прогрессу в области исследований популяционного полиморфизма способствовало открытие K. Mullis в 1983г. полимеразной цепной реакции и развитие на ее основе новых методов и технологий HLA типирования [2,3].

В Азербайджане, проводившиеся исследования полиморфизма системы HLA, касались главным образом антигенов I класса и поэтому имеющиеся отечественные публикации посвящены изучению распределения антигенов этого класса и в основном у женщин с воспалительными заболеваниями гениталий [1,6,7].

Целью настоящего исследования явилось изучение частоты распределения локуса HLA-антигенов II класса у супружеских пар с различными осложнениями беременности в азербайджанской популяции.

Материал и методы. Обследовано 152 семейные пары с различными осложнениями беременности и рождением ребенка с ВПР (основная группа) и 22 семейные пары без осложнений, составивших контрольную группу.

Из осложнений беременности в анамнезе у женщин отмечались выкидыши, не менее 3-х выкидышей в анамнезе у 60 (39,5±6,3%, р≤0,001), неразвивающая беременность – у 35 (23,0±5,1%, р≤0,001), ВПР плода у 29 (19,1±6,3%, р≤0,001), гибель плода внутриутробно и сразу после рождения - у 21 (13,8±3,5%, р≤0,001), преждевременные роды в анамнезе – у 7 (4,6±1,3%, р≤0,001) пар. Пациентки были в возрасте от 20 до 32 лет, средний возраст – 25,7±4,3 лет. Контрольная группа была сопоставима по возрасту с основной группой, средний возраст составил – 26,1±2,8 лет.

Все супруги были протипированы по локусу HLA-DR и HLA-DQ.

Геномную ДНК выделяли из периферической крови методом высаливания по стандартной процедуре [10]. HLA генотипирование образцов ДНК проводили методом мультипраймерной ПЦР. Для типирования генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1) использовали наборы HLA-ДНК-Тех (фирма «НПФ ДНК-Технология», Россия). Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере типа МС2 «Терцик» («НПФ ДНК-Технология", Москва).

Статистическая обработка данных включала определение частот гена DRB1 и гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1, относительного риска (RR), вычисленного по формуле B.Woolf [5]. Достоверность значений определяли по точному двустороннему критерию Фишера без корректировки на количество аллелей.

Результаты и обсуждение. В целом, генотипирование вариантов HLA II класса у всех обследованных выявило 38 аллелей по трем локусам (DRB1-14, DQA1-11, DQB1-13).

При анализе полиморфизма групп аллелей гена DRB1* в сравнении с контрольной группой установлены различия в частоте встречаемости ряда специфичностей локуса DRB1* как в сторону увеличения, так и в сторону снижения, что оценивалось, соответственно, как фактор предрасположенности и резистентности (рис.1).

В основной группе чаще всего встречались аллели DRB1*11 (23,85%, RR=2,1), DRB1*04 (15,46%, RR=1,28), DRB1*13 (11,68%, RR=0,76) и DRB1*15 (11,51%, RR=1,30). В контрольной группе наиболее часто встречаемые аллели DRB1* распределились следующим образом: DRB1*13 встречался в 14,77%, DRB1*11*- в 13,64%, DRB1*04 – в 12,50% и DRB1*07- в 12,50% случаев. В тоже время в основной группе реже, по сравнению с контролем типировались варианты HLA-DRB1*01 - 7,40% (контроль- 11,36%), HLA-DRB1*07 – 6,74% случаев (контроль – 12,5%). Фенотип HLA-DRB1*18 определялся лишь в основной группе, причем у женщин, но очень редко, составив всего лишь 0,16% .

 Рис.1. Частота встречаемости фенотипов HLA DRB1 в супружеских парах (в %)

Встречаемость локуса HLA-DRB1 была наибольшая в группе пар, где женщины имели выкидыши в анамнезе. В этой группе сравнительный анализ позволил выявить частую встречаемость аллеля DRB1*11. Так, из общего выявленного числа (145) доля этого аллеля, а также аллелей DRB1*13 и DRB1*15 в группе пар с выкидышами составила соответственно 25,52% (RR=1,15, р<0,001), 32,39% (RR=0,61, р<0,05) и 34,28% (RR=1,11, р<0,001). В группе пар с гибелью плода в анамнезе аллель DRB1*11 выявлялся в 23,44% случаев (RR=4,27, р<0,001), с неразвивающейся беременностью – в 27,59% (RR=5,47, р<0,001), с ВПР плода – 15,86% (RR=1,57, р<0,001), в группе с преждевременными родами – 7,57% (RR=4,10, р<0,001). Аллель DRB1*04 с одинаковой частотой – 26,59%, но с различным относительным риском встречался в группе с выкидышами и ВПР плода, соответственно RR=0,81 (р<0,001) и RR=1,92 (р<0,001). Отметим сравнительно высокую частоту аллеля DRB1*13 в группе с неразвивающейся беременностью – 35,21% (RR=2,51, р<0,001) и минимальную - в группе с преждевременными родами – 4,22% (RR=0,69, р<0,001). Аллель DRB1*15, помимо группы с выкидышами, также часто выявлялся в группе с ВПР – 32,86% (RR=2,47, р<0,001).

Из числа вариантов HLA локуса DQA1* в основной группе значительно чаще встречались варианты DQA1*0501 - 35,03%, RR=1,15 (контроль – 31,82%), DQA1*0301 – 17,43%, RR=1,05 (контроль – 12,50%), DQA1*0101 - 13,16%, RR=0,80 (контроль – 15,91%) (рис.2). Тенденцию к повышению частоты встречаемости имел вариант DQA1*0102 – 12,50%, RR=0,14 (контроль- 6,82%). В основной группе встречались варианты, не выявленные в контрольной группе. Так, вариант DQA1*0301/4 встречался лишь у мужчин в 0,16% случаев, а вариант DQA1*0406 – лишь у женщин в 0,33% случаев, вариант DQA1*0401 одинаково часто типировался и у мужчин (0,16%), и у женщин (0,16%). Вариант DQA1*01 в контрольной группе выявлялся лишь у мужчин – 3,41%.

Рис.2. Частота встречаемости фенотипов HLA DQA1 в супружеских парах (в %)

Выявлена частая встречаемость аллеля DQA1*0501 локуса HLA-DQA1, в группе с выки-дышами – 42,72% (RR=1,31, р<0,001) и в группе с неразвивающейся беременностью – 24,88% (RR=3,22, р<0,001). В группе пар с преждевременными родами в анамнезе отмечался невысокий процент встречаемости – 9,39%, но высокий относительный риск – 5,36 (р<0,001). Аллели DQA1*0101 и DQA1*0301 в группе с выкидышами составили 45,0% (RR=0,93, р<0,001) и 42,42% (RR=1,85, р<0,001) соответственно. Также часто и с одинаковой частотой эти варианты определялись в группе с неразвивающейся беременностью в 22,64% (RR=2,83, р<0,001) случаев соответственно. Минимальная частота аллелей DQA1*0101 (2,50%, RR=0,41, р<0,001) и DQA1*0301 (3,77%, RR=1,14, р<0,001) отмечалась в группе пар с наличием преждевременных родов в анамнезе.

В локусе HLA-DQB1* значимое повышение частоты встречаемости отмечалось для аллеля DQB1*0301 - 27,14%, RR=1,68 (контроль – 18,18%), DQB1*0201 - 14,80%, RR=1,10 (контроль – 13,64%), DQB1*0602-8 - 13,49%, RR= 1,00 (контроль – 13,64%) (рис.3). В то же время значимое снижение частоты зарегистрировано для аллеля DQB1*0501 – 10,53%, RR=0,65 (контроль – 14,77%). Более часто с высоким относительным риском вариант DQB1*0301 выявлялся в группе с выкидышами (42,42%, RR=1,85, р<0,001) и неразвивающейся беременностью (24,24%, RR=1,80, р<0,001). В группе с преждевременными родами при относительно невысокой частоте (7,88%) этого аллеля отмечался значительный относительный риск (RR=3,90, р<0,001). В этой же группе выявлялась высокая встречаемость DQB1*0201 – 51,11% (RR=3,90, р<0,001) и DQB1*0602-8 – 41,46% (RR=1,04, р<0,001). В других группах частота этих аллелей и относительный риск были невысокими.

Рис.3. Частота встречае-мости фенотипов HLADQВ1 в супружеских парах (в %)

При анализе двух-локусных гаплотипов у обследованных пар как основной, так и контрольной групп выявилась частая встречаемость DQA1*0501/ DQВ1*0301 - 25,5%, RR=1,66 (контроль - 17,0%), DRB1*11/DQA1*0501 – 23,2%, RR=2,11 (контроль – 12,5%), DRB1*04/ DQA1*0301 – 14,6%, RR=1,50 (контроль – 10,2%). При этом большую долю гаплотипа DQA1*0501/DQВ1*0301 имела группа с выкидышами – 38,06% (RR=3,26, р<0,001), неразвивающейся беременностью – 24,52% (RR=4,43, р<0,001) и ВПР плода – 12,90% (RR=2,08, р<0,001). В группе с преждевременными родами этот вариант отмечался в 9,03% случаев (RR=10,00). Двухлокусный гаплотип DRB1*11/DQA1*0501 чаще выявлялся в группе с выкидышами – 38,30% (RR=2,03, р<0,001) и с гибелью плода - 22,69% (RR=4,31, р<0,001). В группе с преждевременными родами его частота составила 7,80% (RR=4,53, р<0,001). 

Из трехлокусных гаплотипов чаще встречалась ассоциация DRB1*11/ DQA1*0501/DQВ1*0301 – 21,5%, RR=2,14 (контроль – 11,3%), DRB1*04/ DQA1*0301/DQВ1*0302 – 8,0%, RR=1,20 (контроль – 6,8%), DRB1*17/ DQA1*0501/ DQВ1*0201 – 6,9%, RR=0,95 (контроль – 7,9%). Доля DRB1*11/ DQA1*0501/DQВ1*0301 была наибольшая в группе с выкидышами и неразвивающейся беременностью– 41,22% (RR=3,35, р<0,001) и 24,43% (RR=2,31, р<0,001) соответственно, а относительный риск – в группе с преждевременными родами (RR=7,49, р<0,001). 

Как видно, наиболее достоверно высокая величина относительного риска отмечалась при двух- и трехлокусных гаплотипах. Известно, что RR означает, во сколько раз чаще встречается заболевание при наличии в генотипе индивидуумов какого-либо варианта HLA генов по сравнению с частотой заболевания у индивидуумов без этого HLA варианта. Значения RR большие, чем 1, свидетельствуют о том, что конкретный вариант гена ассоциирован с развитием заболевания, причем, чем больше величина относительного риска, тем ассоциация более выражена. Значения RR, меньшие, чем 1, свидетельствуют об ассоциации вариантов HLA генов с устойчивостью к развитию заболевания, причем, чем меньше величина относительного риска, тем ассоциация того или иного варианта гена DRB1 или DQA1 с устойчивостью к развитию заболевания более выражена. Значениия RR, близкие к 1, свидетельствует об отсутствии ассоциаций .

Таким образом, с выкидышами были ассоциированы трех- DRB1*11/ DQA1*0501/DQВ1*0301 и двухлокусные ассоциации DQA1*0501/ DQВ1*0301 и DRB1*11/DQA1*0501, а также аллели DQB1*0301 и DQA1*0301, с неразвивающейся беременностью - DQA1*0501/DQВ1*0301, DRB1*11/ DQA1*0501/DQВ1*0301, DRB1*11/DQA1*0501, DQB1*0301, DQA1*0501, с ВПР - DRB1*15, DRB1*04, DQA1*0501/ DQВ1*0301 и DRB1*11/ DQA1*0501/DQВ1*0301, с гибелью плода - DRB1*11, DRB1*04, DQA1*0501/ DQВ1*0301, DRB1*11/ DQA1*0501/DQВ1*0301. Преждевременные роды были связаны сильной ассоциативной связью с гаплотипами DQA1*0501/ DQВ1*0301, DRB1*11/DQA1*0501, DRB1*11/ DQA1*0501/DQВ1*0301, DQA1*0501 DRB1*11, DQB1*0301. Следовательно, сила ассоциативных связей для выкидышей, неразвивающейся беременности, ВПР, гибелью плода была более высокой с гаплотипами, а преждевременные роды были связаны и с гаплотипами и с отдельными специфичностями HLA.

В целом же для пар, где женщина имела отягощенный по осложнениям беременности анамнез превалировали аллели DRB1*11 (23,85%, RR=2,1), DQA1*0501 (35,03%, RR=1,15), DRB1*11 (23,85%, RR=2,1), а также локусы DRB1*11/DQA1*0501 (23,2%, RR=2,11), DRB1*11/ DQA1*0501/ DQВ1*0301 (21,5%, RR=2,14).

 

ƏDƏBİYYАT - LİTERАTURА– REFERENCES:

 

1.Аббасова З.Ф. Особенности диагностики и клиники туберкулеза гениталий у женщин в современных условиях / Дисс… канд. мед. наук. Баку, 1996, 157 с.
2.Антонова И.В., Антонов О.В. Проблемы и перспективы развития пренатальной диагностики // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии, 2009, №8, Т1, с. 76-83
3.Баранов В.С. Молекулярная медицина: молекулярная диагностика, превентивная медицина и генная терапия // Мол. биология, 2000, а 34, N4, с. 684
4.Бочков Н.П., Лазюк Г.И. Вклад генетических факторов в перинатальную патологию и детскую смертность // Вестн АМН СССР, 1991, №5, с.11-13
5.Гланц Ст. Медико-биологическая статистика / Пер. с англ. под ред. Н.Е.Бузикашвили и Д.В.Самойлова. М.: Практика, 1999, 200 с.
6.Казиева Н.Х., Меликова Л.А., Смирнова Е.Е., Мамед-заде Г.Т. Практические аспекты врожденной патологии у новорожденных от матерей групп высокого риска / Актуальн. вопр. здравоохранения Азербайджана. Сб. науч. трудов. Баку, 1998, с. 81-82
7.Тагиева Ф.А. Воспалительные заболевания женских половых органов: иммунологический аспект проблемы // Азерб. мед. журнал, 1999, №3, с.80-83
8.Christiansen O.B., Christiansen B.S., Husth M. et al. Prospective study of anticardiolipin antibodies in immunized and untreated women with recurrent spontaneous abortion // Fertil Steril., 1992, v.58, N2, p.328-334
9.Christiansen O.B., Mathiesen O., Riisom K., Lauritsen J.G. et al. HLA or HLA-linked genes reduce birthweight in families affected by idiopathic recurrent abortion // Tissue Antigens, 1990, v.36, p.156–163
10.Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells // Nucleic Acids Res., 1988, v.16, p.1215–1218
11.Rasmussen S.A., Lammer E.J., Shaw G.M. et al. Integration of DNA sample collection into a multi-site birth defects case-control study // Teratology, 2002, v.66, p.177-184
12.Аbbasova Z.F. Osobennosti diaqnostiki i kliniki tuberkuleza qenitaliy u jenhin v sovremennıx usloviəx / Diss… kand. med. nauk. Baku, 1996, 157 s
13.Аntonova İ.V., Аntonov O.V. Problemı i perspektivı razvitiə prenatalğnoy diaqnostiki // Voprosı qinekoloqii, akuşerstva i perinatoloqii, 2009, №8, T1, s. 76-83
14.Baranov V.S. Molekulərnaə mediüina: molekulərnaə diaqnostika, preventivnaə mediüina i qennaə terapiə // Mol. bioloqiə, 2000, a 34, N4, s. 684
15.Boçkov N.P., Lazök Q.İ. Vklad qenetiçeskix faktorov v perinatalğnuö patoloqiö i detskuö smertnostğ // Vestn АMN SSSR, 1991, №5, s.11-13
16.Qlanü St. Mediko-bioloqiçeskaə statistika / Per. s anql. pod red. N.E.Buzikaşvili i D.V.Samoylova. M.: Praktika, 1999, 200 s.
17.Kazieva N.X., Melikova L.А., Smirnova E.E., Mamed-zade Q.T. Praktiçeskie aspektı vrojdennoy patoloqii u novorojdennıx ot materey qrupp vısokoqo riska / Аktualğn. vopr. zdravooxraneniə Аzerbaydjana. Sb. nauç. trudov. Baku, 1998, s. 81-82
18Taqieva F.А. Vospalitelğnıe zabolevaniə jenskix polovıx orqanov: immunoloqiçeskiy aspekt problemı // Аzerb. med. jurnal, 1999, №3, s.80-83
19.Christiansen O.B., Christiansen B.S., Husth M. et al. Prospective study of anticardiolipin antibodies in immunized and untreated women with recurrent spontaneous abortion // Fertil Steril., 1992, v.58, N2, p.328-334
20.Christiansen O.B., Mathiesen O., Riisom K., Lauritsen J.G. et al. HLA or HLA-linked genes reduce birthweight in families affected by idiopathic recurrent abortion // Tissue Antigens, 1990, v.36, p.156–163
21.Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells // Nucleic Acids Res., 1988, v.16, p.1215–1218
22.Rasmussen S.A., Lammer E.J., Shaw G.M. et al. Integration of DNA sample collection into a multi-site birth defects case-control study // Teratology, 2002, v.66, p.177-184