SAĞLAMLIQ

АZƏRBAYCAN RESPUBLİKASINDAKI BRUSELLOZ XƏSTƏLƏRİNDƏ TLR-4 POLİMORFİZMİ

04-02-2019

Выводы: доказана взаимосвязь между полиморфизмом TLR-4 (Asp299Gly) и восприимчивостью к бруцеллезу.

Ключевые слова: острый бруцеллез, Toll-подобные рецепторы, цитокины, полиморфизм, генотип.

Вступление. Бруцеллез является одной из наиболее распространённых зоонозных инфекций в мире с высоким процентом хронических форм. Что соответственно негативно влияет на экономическую составляющею систем здравоохранения стран с высокой распространённостью бруцеллеза [1, 2]. Одни с наиболее высоких показателей бруцеллеза наблюдаются в странах Центральной Азии и Восточной Европы [3, 4]. По разным данным в мире регистрируется от нескольких миллионов до 500 тысяч новых случаев бруцеллеза ежегодно [5, 6].

Известно, что первой линией защиты организма от инфекционных агентов, в том числе и бруцел, является система врожденного иммунитета [7]. Одной с ключевых составляющих врожденной иммунной системы являются Toll-подоб-ные рецепторы (TLR). TLR распознают патоген-ассоциированные молекулярные структуры (PAMPs), которые активируют сигнальные процессы и стимулируют экспрессию эфекторных молекул, тем самым контролируют адаптивные иммунные ответы [8]. Благодаря полиморфной природе генов TLR, данные рецепторы имеют определенные генетические вариации, которые осуществляют существенное влияние на патогенез воспалительных заболеваний [9, 10].

TLR-4 является рецептором распознавания структуры экзогенного липополисахарида, связанного с грамнегативной бактериальной микрофлорой. Кроме бактериальных липополисахаридов, он также связывается с эндогенными фрагментами тканей, а именно с продуктами распада внеклеточного матрикса [11]. В настоящие время известны и активно изучаются два основных полиморфизма TLR-4, а именно Asp299Gly и Thr399Ile, которые объединены динамичной связью. Однако наиболее важное значение для инфектологии имеет полиморфизм Asp299Gly, который играет важную роль в угнетении синтеза провоспалительных цитокинов [12, 13]. При этом он поддерживает воспалительные реакции в организме человека.

В результате активации TLR-4 осуществляется широкий спектр биологических реакций – от индукции синтеза провоспалительных (например, интерлейкинов 1, 6, 12) цитокинов, интерферонов, простагландинов до экспрес-сии взаимостимулирующих молекул, которые являются промоторами Т-кле-точной активации и определяют развитие адаптивного иммунного ответа [14].

Доказана роль полиморфизма в возникновении малярии, лейшманиоза, брюшного тифа, нейроцистецеркоза, а также инфекций мочевыделительных путей у взрослых. Интересно, что все эти данные были получены для азиатской популяции [15].

На сегодняшний день изучение полиморфизма генов регуляторных молекул воспаления обретает особенную актуальность. Определение их роли в патогенезе многих заболеваний, в том числе и бруцеллеза, вместе с достижениями современной геномики, позволяют прогнозировать риск развития патологии или тяжесть ее течения, с другой стороны – персонифи-цировать фармакотерапию.

Цель исследования Определить частоту полиморфизма TLR-4 (Asp299Gly) у пациентов с острым бруцеллезом в республике Азербайджан, учитывая тяжесть течения заболевания.

Материалы и методы исследования В рамках данной работы было обследовано 178 больных с признаками бруцеллеза, которые обращались за медицинской помощью в Baku Clinic и Центральную клиническую больницу г. Баку в течение 2012-2017 г.г. У всех пациентов было получено разрешение на включение их в исследование.

Диагноз острого бруцеллеза выставлялся на основании клинических данных, анамнеза, в том числе и эпидемиологического, данных объективного обследования, результатов специфической и неспецифической лабораторной диагностики.

Специфические методы исследования проводились методом ИФА на аппаратах Awareness и Stat Fax 3200 с использованием тест-систем NovaLisa Brusella IgG, IgM (Германия) с выявлением IgM и IgG.

Кроме, данных специфической диагностики, при установлении диагноза острый бруцеллез учитывалась длительность клинических симптомов до 3 месяцев с момента появления первых жалоб.

Согласно критериям включения в исследование из 178 обследованных больных полностью соответствовало всем критериям только 120 человек, которые и составили основную группу. Контрольную группу составили 30 практически здоровых лиц, проходивших плановый ежегодный осмотр. Группы были репрезентативны по возрасту и полу. Пациенты обеих групп являются этническими азербайджанцами, постоянно проживающие на территории респуб-лики Азербайджан. Средний возраст пациентов основной группы составил 35,9±2,8 лет. Среди обследованных преобладали лица мужского пола - 75,00%.

Критерии исключения из исследования: лица в возрасте до 18 лет, подтверждение диагноза подострого или хронического бруцеллеза, наличие тяжелой хронической сопутствующей патологии, которая существенно могла повлиять на достоверность полученных результатов.

Также всем пациентам обеих групп было проведено определение полиморфизма TLR-4 (Asp299Gly). Геномную ДНК выделяли из перифериической венозной крови, забор которой проводился с кубитальной вены в стерильные вакутайнеры со стабилизатором 44 (ЭДТА) с помощью «Комплекта для выделения ДНК / РНК из сыворотки или плазмы крови» (НПФ «ЛиТех», Россия). Полиморфный участок Asp299Gly TLR-4 амплифицировали с помощью ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. Амплификации проводили на амплификаторе «Терцик» («ДНК Технология», Москва). Смесь для ПЦР объемом 25 мкл содержала 2,5 мкл 10-х буфера для амплификации; 2 мМ хлорида магния; по 0,2 ммоль каждого dNTP; по 66 нг специфических праймеров; 2,5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы (СибЭнзим, Россия); 20-50 нг геномной ДНК. В пробирки наслаивали 25 мкл минерального масла. Температура отжига для определения полиморфного участка Asp299Gly TLR-4 - 58ºС. Для идентификации аллелей гена TLR4 применяли рестрикционный анализ ампликонов с помощью эндонуклеазы рестрикции Bsp19 (СибЭнзим, Россия) при температуре 37° С. Продукты расщепления полиморфного участка генов TLR4 выявляли с помощью электрофореза в 3% агарозном геле в 1 х TBEбуферы (в течение 2 ч. при напряжении 2V на 1 см геля). В качестве маркера молекулярного веса ДНК использовали pBR322 / BsuRI. Гели окрашивали етидиумом бромидом с последующей визуализацией результатов в УФ-свете.

Достоверность различий в распределении генотипов по полиморфным локусам между группами проверялась на соответствие равновесия Харди-Вайнберга.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью программы «STATISTICA 6,0». Использованы параметрический тест Стьюдента для сравнения двух независимых выборок и одномерный дисперсионный анализ для сравнения более 2 независимых выборок. Достоверными считали значение р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение.При анализе полиморфизма TLR-4 (Asp299Gly) было выявлено, что достоверно чаще среди больных бруцеллезом встречается генотип AG (68,33%) по сравнению с контрольной группой, где частота данного генотипа составила лишь 6,67%. Тогда как, генотип АА в 3,1 раза чаще регистрировался среди здоровых лиц, чем среди больных основной группы (90,00% против 29,17%). При анализе частоты распределения аллелей А и G TLR-4 (Asp299Gly) достоверная разница была обнаружена в обеих группах, так количество носителей алели G почти в 2 раза была выше среди больных бруцеллезом, тогда как среди здоровых лиц преобладали носители аллели А (р <0,05) (табл.1).

Таблица  №1

Частота выявления полиморфизма (Asp299Gly) гена TLR-4 у больных острым бруцеллезом и здоровых лиц

Примечание: * р <0,05- между больными острый бруцеллез и здоровыми лицами.

Все пациенты основной группы были разделены на три подгруппы по степени тяжести: легкая, средняя и тяжелая. Критерием тяжести служили следующие симптомы: лихорадка, потливость, озноб, головная боль, бессонница, снижение артериального давления, тахикардия, гепатоспленомегалия, миокардиты, перикардит, эндокардит, изменения в общем анализе крови, уровни провоспалительных и противовоспалительных цитокинов [16]. Так, легкая степень была установлена у 74 (61,66%) человек, средняя степень - у 35 (29,17%) человек и лишь у 11 (9,17%) пациентов состояние было тяжелым (рис.1).

 

Рис.1. Распределение больных бруцеллезом в зависимости от степени тяжести.

 

Было установлено, что генотип AG гена TLR-4 почти в 2 раза чаще выявлялся у больных острым бруцеллезом средней степени тяжести, чем с легким течением заболевания (р <0,05). При других генотипах и различных степенях тяжести достоверных различий найдено не было (табл. 2).

Таблица  №2

Частота выявления полиморфизма (Asp299Gly) гена TLR-4 у больных бруцеллезом в зависимости от степени тяжести

Генотипы TLR-4 (Asp299Gly)	Больные бруцеллезом (n=120)
	Легкая степень (n=74)		Средняя степень тяжести (n=35)		Тяжелая степень (n=11)
	Абс.	%	Абс.	%	Абс.	%
AA	33	44,59	2	5,71	0	0
AG	40	54,06	33	94,29*	9	81,82
GG	1	1,35	0	0	2	18,18

Примечание: * р <0,05 - между больными бруцеллезом с различными степенями тяжести.

 

Роль полиморфизма TLR-4 и его взаимосвязь с бруцеллезом является неоднозначным и малоизученным. На данный момент существуют единичные данные, так в одном исследовании был проанализирован полиморфизм (Asp299Gly) гена TLR-4 у больных с бруцеллезом. На основе анализа которого, ученые сделали вывод, что аллель G был более распространенным у пациентов с бруцеллезом по сравнению со здоровыми людьми (33,6% против 20,7%, р=0,000003). Также установлено, что частота аллели G гена TLR4 была значительно выше у лиц мужского пола больных бруцеллезом по сравнению с аналогичным полом в контрольной группе (36% против 21,7%, р=0,00005). Анализ множественной логистической регрессии в этом исследовании показал, что пациенты мужчины с генотипом АG имеют значительно более высокий риск возникновения бруцеллеза. То есть это исследование, впервые выявило связь между генетическим полиморфизмом гена TLR4 и восприимчивостью к бруцеллезу [17].

Полученные нами данные, в чем-то совпадают с результатами исследований, так нами установлено, что чаще среди больных бруцеллезом встречается генотип AG (68,33%) по сравнению с контрольной группой. Тогда как, генотип АА в 3,1 раза чаще регистрировался среди здоровых лиц, чем среди больных бруцеллезом.

Учитывая проанализированные литературные данные и полученные нами результаты, считаем необходимым проводить дальнейший научный поиск, по данной проблеме учитывая крайне ограниченные данные по этому вопросу.

Выводы

1. Генотип AG (Asp299Gly) гена TLR-4 в 10 раз чаще встречался среди больных бруцеллезом, тогда как генотип АА, наоборот, в 3,1 раза чаще регистрировался среди здоровых лиц.

2. Установлено, что генотип TLR-4 (Asp299Gly) AG достоверно чаще ассоциируется с течением бруцеллеза средней степени тяжести.

 

E-mail: [email protected]

ƏDƏBİYYAT - ЛИТЕРАТУРА– REFERENCES:

 

1.Najafi N. Investigating the Epidemiologic, Laboratory, and Clinical Features of Brucellosis Patients Hospitalized in the North of Iran During 2009-2014 //Cough. – 2018. – Т. 30. – С. 13.7.
2.Mugahi S. Epidemiological features, clinical manifestation and laboratory findings of patients with brucellosis //Archives of Clinical Infectious Diseases. – 2014. – Т. 9. – №. 1.
3.Pappas G. Medical progress: brucellosis //The New England Journal of Medicine. – 2005. – Т. 352. – №. 22. – С. 2325-2336.
4.Garcell H. G. Outbreaks of brucellosis related to the consumption of unpasteurized camel milk //Journal of infection and public health. – 2016. – Т. 9. – №. 4. – С. 523-527.
5.Nourbakhsh F. Diagnosis of clinical and laboratory findings of brucellosis in Isfahan //International Archives of Health Sciences. – 2017. – Т. 4. – №. 2. – С. 48.
6.Reza M. ASerum interferon-gamma and interleukin-4 in patients with brucellosis before and after treatme //Asian Pacific Journal of Tropical Disease. – 2017. – Т. 7. – №. 7. – С. 396-400.
7.Юрко К. В. Поширеність поліморфізму гену TLR-4 у хворих на ко-інфекцію ВІЛ/ХГС //ScienceRise. Medical science. – 2015. – №. 11 (3). – С. 86-89.
8.Andreakos E., Foxwell B., Feldmann M. Is targeting Toll‐like receptors and their signaling pathway a useful therapeutic approach to modulating cytokine‐driven inflammation? //Immunological reviews. – 2004. – Т. 202. – №. 1. – С. 250-265.
9.Schröder N. W. J., Schumann R. R. Single nucleotide polymorphisms of Toll-like receptors and susceptibility to infectious disease //The Lancet infectious diseases. – 2005. – Т. 5. – №. 3. – С. 156-164.
10.Guven MThe effect of genetic polymorphisms of TLR2 and TLR4 in Turkish patients with coronary artery disease //Gene. – 2015. – Т. 568. – №. 2. – С. 229-232.
11.Misch E. A., Hawn T. R. Toll-like receptor polymorphisms and susceptibility to human disease //Clinical Science. – 2008. – Т. 114. – №. 5. – С. 347-360.
12.Ferwerda B. Functional consequences of toll-like receptor 4 polymorphisms //Molecular medicine. – 2008. – Т. 14. – №. 5-6. – С. 346-352.
13.Крючко Т. А., Ткаченко О. Я., Вовк Ю. А. Врожденные компоненты иммунитета: Toll-подобные рецепторы в норме и при патологии //Здоровье ребенка. – 2010. – №. 6.
14.Кириченко Т. С. Клинико-иммунологическая характеристика ВИЧ-инфекции у больных с полиморфизмом Asp299Gly гена Toll-подобного рецептора 4. – 2013.
15.Ziakas P. D. The role of TLR4 896 A> G and 1196 C> T in susceptibility to infections: a review and meta-analysis of genetic association studies //PLoS One. – 2013. – Т. 8. – №. 11. – С. e81047.
16.Белозеров Е. С. Бруцеллез / Е. С. Белозеров. – Ленинград : Медицина, 1985. – 184 с.
17.Rezazadeh M. TLR4 polymorphism in Iranian patients with brucellosis //Journal of infection. – 2006. – Т. 53. – №. 3. – С. 206-210.