SAĞLAMLIQ

ВЛИЯНИЯ КУРКУМЫ НА ПРОСТРАНСТВЕННОЕ ПОВЕДЕНИЕ И ПАМЯТЬ ЖИВОТНЫХ

04-09-2019

Животные модели заболеваний являются незаменимыми для процесса разработки лекарств. Их функция заключается в том, чтобы точно имитировать заболевание или аспект заболевания у людей и переводить результаты, полученные in vitro, для клинического применения. Потребность в животных моделях патологий, поражающих центральную нервную систему, была признана с 1980 г. [1-5]. Попытка установить критерии для таких животных моделей была предпринята в том же году [2]. Первые инструменты, описанные как модели болезни Альцгеймера (БА) на животных, были основаны на этиологических соображениях болезней, которые считались причиной нейродегенерации. Стратегия разработки моделей для изучения БА заключалась в том, чтобы воспроизвести патологические признаки, наблюдаемые при БА.

Снижение когнитивной функции, памяти и поведения свидетельствует о прогрессирующем БA, а на физиологическом уровне болезнь характеризуется образованием амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков в ткани мозга, которые способствуют нейродегенерации, блокируя клеточную сигнальную активность.

В литературе приводятся результаты экспериментальных исследований моделей БА на грызунах, которые показали, что добавки с куркумой /куркумином снижают уровень окисленных белков и воспалительных цитокинов в мозге. Однако исследований и сведений, подтверждающие, что добавление куркумы предотвращает дефицит памяти и снижение когнитивных способностей, ограничено.

На основании результатов экспериментальных исследований на животных выявлено, что куркума легко проникает в мозг из крови, связывается с амилоидными бляшками мозга при БА. Помимо этого, обнаружено, что диетический или инъекционный куркумин также может проникать в сетчатку и связываться с другими не обнаруженными бляшками. Используя современную микроскопию, ученые смогли исследовать сетчатки на моделях животных с БА и четко визуализировать все отдельные бляшки [6-11]. Что еще более важно, бляшки сетчатки были обнаружены за несколько месяцев до того, как они развились в мозге. Исследователи также успешно проверили методику на людях, у которых не было выявлено никаких симптомов БА, но впоследствии было обнаружено наличие диффузных мозговых бляшек [6].

В литературе приводятся сообщения о полезности куркумы в разных неинвазивных диагностических тестах на БА. Это делает ее разумным выбором для дальнейших исследований и клинических испытаний.

Цель исследования – оценить воздействие куркумы на пространственное поведение и память у крыс с моделью болезни Альцгеймера.

Материал и методы. Эксперименты проведены на белых беспородных крысах массой 250-300 гр. В эксперименте использованы крысы обоего пола. Содержание животных и экспериментальные исследования проводились в соответствии с правилами руководства по уходу и использования лабораторных животных (NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) и их соблюдением [12].

Животные содержались в стандартных условиях вивария: при температуре 23±1°С, режим вентиляции 30 м/с, с 12-ти часовым дневным и 12-ти часовым ночным освещением. Грызуны получали в достаточном количестве полноценный корм и воду. В эксперименте использовали водный лабиринт Морриса (ВЛМ). В начале эксперимента животных приучали к рукам, в течение 4-5 суток. В последующие 5-6 суток у грызунов вырабатывали поисковую активность нахождения «невидимой» платформы в ВЛМ. Исследуемые животные были разделены на три группы, которые включали по 5 особей крыс - самок и самцов. Первая группа (интактная) - самки и самцы крыс этой группы не подвергались никаким манипуляциям. Второй (n=10) и третьей группе (n=10) животных была проведена бульбэктомия. На крысах этих групп была создана экспериментальная модель БА. Куркуму вводили крысам III группы в течение 1 месяца. После этого продолжили тестирование животных I группы (интактные), II группы (крысы с моделированной БА) и III группы (крысы с моделированной БА и с введенной куркумой). После периода реабилитации, т.е. через 2,5 месяца, особям III группы в течение 1 месяца вводили перорально 2,5 мг водного раствора куркумы. Раствор готовили следующим образом: 2,5 мг порошка куркумы растворяли в 50 мл кипяченной охлажденной воды. Спустя месяц животных тестировали в бассейне Морриса. Статистическая обработка полученных результатов проведена с помощью программ «Statistica for Windows 8.0» и «Microsoft Excel». Данные представлены в виде M±SD, где М – среднее значение (average), SD – стандартное отклонение среднего (Standard Deviation). Различия считали достоверными при значении p<0,05.

Результаты и обсуждение. Спустя 2,5 месяца крысы, не подвергшиеся бульбэктомии (интактные), находили невидимую платформу в течение 20-30 сек. После введения куркумы крысам с экспериментальной БА, сравнивали время нахождения платформы крыс всех групп (рис.1).

Соответственно данным рис.1, крысы II группы в первый день находили скрытую платформу в среднем за 80,2±9,74 сек, на второй день время поиска уменьшилось в 1,1 раза и составило в среднем 69,5±9,11 сек. Животные III группы с моделью БА, и получившие 2,5 мг куркумы, в первый день находили платформу за 84,7±8,92 сек, а на второй день время поиска сократилось в 1,5 раза (р<0,05), составив в среднем 56,3±9,0 сек.

 

Рис.1. Время (сек) поиска платформы крысами в водном лабиринте Морриса после 2-х дней обучения

Обращал на себя внимание тот факт, что крысы III группы, получившие куркуму, находились в целевом сегменте ВЛМ дольше, чем интактные животные (рис.2).

 

Рис.2. Время пребывания крыс в целевом сегменте в день воспроизведения

Как видно из рис.2, крысы, получившие куркуму, находились в целевом сегменте в 1,7 раза (р<0,05) дольше, чем контрольные.

Сравнительный анализ всех 7 дней обуче-ния показал, что, начиная с 3 дня у животных, которым вводили куркуму, проявлялся эффект (рис.3).

Из представленных показателей на рис.3 следует, что в первый день больше всех времени на поиск невидимой платформы потратили животные III группы, т.е. крысы, которым была введена куркума. Так, если животные контрольной группы находили платформу за 28,8±6,82 сек, то крысы после бульбэктомии, т.е. II и III групп, находили площадку в течение 79,9±9,01 сек и 83,3±10,52 сек соответственно, что в среднем было больше в 2,8-2,9 раза (р<0,01) соответственно. На второй день время поиска уменьшилось во всех опытных группах: интактные крысы нашли платформу за 23,4±5,44 сек, животные II и III групп – в течение 68,8±8,17 сек и 56,1±6,12 сек соответственно. Как видно, по сравнению с контролем, время поиска платформы у животных II и III групп было больше в 2,9 раза (р<0,01) и в 2,4 раза (р<0,05) соответственно. Обращает на себя внимание то, что у крыс с моделью БА, которым вводили куркуму, время поиска было меньше, чем у крыс с моделью БА без введения этого вещества, разница составила 22,6%.

На третий день тестирования время поиска платформы снизилось во всех группах. Интактные животные (I группа) находили платформу в среднем в течение 11,3±5,88 сек, животные с моделью БА (II группа) – за 53,0±7,72 сек и крысы с моделью БА и введенной куркумой (III группа) – за 39,1±7,08 сек. Сравнительный анализ показал, что разница во времени поиска животными II и III группы с контрольной была больше соответственно в 4,7 раза (р<0,01) и в 3,5 раза (р<0,01). На четвертый день тестирования интактные крысы находили платформу в течение 14,0±7,34 сек, животные II и III группы – в течение 50,1±5,27 сек и 38,4±7,24 сек соответственно. Как видим, у интактных крыс время нахождения платформы по сравнению с предыдущим днем повысилось на 19,3%, в то время как, животные II и III группы тратили время на поиск платформы по сравнению со вчерашним днем на 5,8% и 1,8% меньше, соответственно. При сравнении с контрольным показателем выявлено, что крысы с моделью БА потратили время на поиск невидимой платформы в 3,6 раза (р<0,01) больше, а крысы с моделью БА и введенной куркумой в 2,7 раза (р<0,05) больше. На пятый день тестирования на поиск скрытой платформы крысы контрольной группы потратили 12,2±6,04 сек, животные II группы – 46,8±5,62 сек, и крысы III группы – 25,7±4,88 сек. Сопоставление с контрольным показателем показало, что время нахождения платформы крысами II группы по сравнении с интактными животными было больше в 3,8 раза (р<0,01), а крысами III группы – в 2,1 раза (р<0,05). На шестой день тестирования время поиска невидимой платформы животными I группы составило в среднем 9,5±2,66 сек, II группы – 44,5±6,08 сек, III группы – 26,3±5,17 сек. Сравнительный анализ показателей времени нахождения платформы животными с моделью БА – II и III группы с показателем времени нахождения интактными крысами показал, что разница была больше в 4,7 раза (р<0,01) во II и в 2,8 раза (р<0,01) больше в III группе. На седьмой день обучения время нахождения платформы интактными животными составило в среднем 6,4±2,02 сек, животными с моделью БА – 38,8±8,24 сек и крысами с моделью БА, получивших куркуму, – 20,3±6,33 сек. По сравнению с крысами контрольной группы животные II группы искали платформу в 6,1 раза (р<0,001), а крысы III группы в 3,2 раза (р<0,01) дольше.

Следовательно, крысы с моделью БА дольше находились в целевом сегменте, и времени на нахождение невидимой платформы они тратили больше.

 

Рис.3. Влияние куркумы на пространственную ориентацию крыс на модели БА, созданной бульбэктомией, в водном лабиринте Морриса

 Вместе с тем, полученные результаты экспериментального исследования показали, что у крыс после бульбэктомии с моделью БА (II группа) и крыс с моделью БА (III группа), получивших куркуму, длительность поиска платформы различная. В первый день обучения время поиска скрытой платформы у животных после введения куркумы, было дольше на 4,1%, чем у животных, не получивших куркуму. Во второй день тестирования, как мы отметили выше, у крыс III группы время нахождения платформы сократилось, и по сравнению с показателем II группы было меньше на 22,6%. В третий день обучения время поиска платформы у крыс с моделью БА продолжало сокращаться, причем особенно выражено у животных III группы. В сравнении со II группой в этот день обучения время нахождения платформы крысами III группы уменьшилось на 35,6% (р<0,05). В четвертый и пятый день разница между группами составила соответственно 30,5% и 82,1% (р<0,05). В шестой день тестирования время поиска у животных III группы, по сравнению с предыдущим днем, повысилось на 2,3%, а у крыс II группы оно сократилось на 5,2%. Между тем, сравнение между группами показало, что крысы, которым введена куркума, находили платформу быстрее, чем животные II группы, разница составила 66,9% (р<0,05). На седьмой день тестирования отмечено сокращение времени поиска платформы в обеих группах, но крысы, получившие куркуму, воспроизводили навык быстрее, что отражалось на показателе времени, который был на 91,1% меньше (р<0,001), чем у крыс II группы.

Таким образом, эффект улучшения памяти у крыс, которым ввели куркуму, наблюдался с третьего дня обучения и максимальный эффект проявился на седьмой день тестирования.

При измерении времени нахождения животных у стенок бассейна и в целевом квадранте выявлено наличие незначительных различий между II и III группами (табл.1).

Таблица  №1

Время (сек) нахождения животных у стенок бассейна и в целевом секторе в период тестирования

 

Как видно из табл. 1, животные II и III группы снижали латентное время нахождения у стенок резервуара. Так, время нахождения у стенок резервуара на 7 день тестирования по сравнению с 3-м днем во II и III группах сократилось на 55,58% (p<0,05) и 60,46% (p<0,05) соответственно.

Для оценки показателя отсроченного воспроизведения была убрана скрытая площадка и измерено в течение 120 сек время нахождения животных в целевом сегменте (рис.4).

Полученные результаты показали, что дольше всех в целевом квадранте находились крысы с моделью БА, которым ввели куркуму, однако разница с показателями других групп не была статистически значимой. В среднем, время нахождения животных I, II и III групп в целевом квадранте составило 48,14±7,14 сек, 40,6±10,22 и 50,65±9,17 сек соответственно. Исходя из суммарного времени нахождения животных в целевом квадранте в I группе доля нахождения крыс в этом сегменте составила 40,1%, в противоположном квадранте – 17,6%, в левом и правом сегментах соответственно 20,9 и 21,4%. Во II группе доля нахождения крыс в целевом секторе составила 33,8%, в противоположном, левом и правом квадрантах соответственно 25,1%, 22,6% и 18,4%. В III группе доля нахождения крыс в целевом секторе составила 42,2%, в противоположном, левом и правом квадрантах соответственно 20,4%, 18,7% и 18,6%. 

 

Рис. 4. Время нахождения крыс в секторах резервуара без невидимой платформы

Таким образом, результаты исследования показали, что крысы с моделью БА и получившие куркуму лучше выполняли тест ВЛМ, что выражалось в запоминании и сохранении в памяти места расположения скрытой платформы.

Интересным наблюдением проведенного нами экспериментального исследования было то, что процент времени, проведенного в целевом квадранте, уменьшался в последующие дни тестирования по сравнению со значениями, полученными в предыдущие дни тестирования. Помимо этого, данные, собранные в ходе проведенного тестирования, показали, что крысы тратили значительно больший процент времени в целевом квадранте по сравнению с любым другим квадрантом. По нашим данным, интактные крысы (I группа) 40,1% суммарного времени провели в целевом квадранте, 21,4% - в правом квадранте, 20,9% - в левом и 17,6% - в противоположном квадранте. Крысы с моделью БА (II группа) в целевом квадранте находились 33,8% от суммарного времени, в противоположном квадранте – 25,1%, в левом – 22,6% и в правом квадранте – 18,4%. Крысы с моделью БА и введенной куркумой (III группа) 42,2% времени провели в целевом квадранте, 20,4% - в противоположном; 18,7% времени – в левом и 18,6% времени в правом квадранте. Подобные наблюдения были опубликованы в другом исследовании молодых крыс, обученных в водном лабиринте Морриса [13].

Сравнительно высокую долю времени нахождения в целевом сегменте мы интерпретируем как свидетельство пространственной памяти, так как крысы тратили значительно больше своего общего времени плавания в непосредственной близости от места расположения прежней платформы.

Полученные нами результаты показали, что экспериментальным животным потребовалось больше времени, чтобы достичь целевого сегмента на 1-й и 2-й день обучения, по сравнению с контрольной группой. Хотя на 3-й день обучения животным все еще требовалось больше времени, чтобы определить местонахождение скрытой платформы, результаты показали статистически значимое снижение времени поиска. Более того, отмечались достоверные различия между тестируемыми группами по времени нахождения платформы в течение следующих дней обучения.

Полученные нами данные сопоставимы с результатами исследований S.A. Frautschy et al. [14]. Авторы, также, как и мы, вводили крысам диетический куркумин в дозе 500 промилей (2,25 мг) и наблюдали предотвращение вызванного Aβ-инфузией дефицита пространственной памяти в водном лабиринте Морриса и потерю постсинаптической плотности и уменьшения отложения Aβ. Исследователи считают, что из-за низкого профиля побочных эффектов и безопасного использования куркумин может найти клиническое применение для профилактики БА.

Заключение. Введение куркумы ингибировало когнитивные изменения. Обучение привело к значительному уменьшению времени на поиск платформы и значительному увеличению времени плавания в целевом квадранте. Пространственное обучение способствовало тому, что крысам потребовалось меньше времени, чтобы найти платформу и тратить больше времени и длины пути в целевом квадранте, что указывает на то, что они узнали местоположение платформы.

 

ƏDƏBİYYAT - ЛИТЕРАТУРА– REFERENCES:

 

1.Иптышев АМ, Горина ЯВ, Лопатина ОЛ, и др. Экспериментальные модели болезни Альцгеймера: преимущества и недостатки. Сибирское медицинское обозрение. 2016;4:5-21.
2.Drummond E, Wisniewsk T. Alzheimer’s Disease: Experimental Models and Reality. Acta Neuropathol.2017;133(2):155–175. doi: 10.1007/s00401-016-1662-x
3.Chiu K, Chan TF, Wu A, et al. Neurodegeneration of the retina in mouse models of Alzheimer’s disease: what can we learn from the retina?. GeroScience. 2012;34(3):633-649, doi: 10.1007/s11357-011-9260-2
4.Tsai Y, Lu B, Ljubimov AV, et al. Ocular changes in TgF344-AD rat model of Alzheimer’s disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014;55:523–534. doi:10.1167/iovs.13-12888
5.Saraceno C, Musardo S, Marcello E, Pelucchi S, Di Luca M. Modeling Alzheimer’s disease: from past to future. Front. Pharmacol. 2013;4. doi: 10.3389/fphar.2013.00077
6.Koronyo Y, Biggs D, Barron E, et al. Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer’s disease. JCI Insight. 2017;2(16):e93621. https://doi.org/10.1172/jci.insight.93621 
7.Chen M, Du ZY, Zheng X et al. K. Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease. Neural Regen Res 2018;13:742-52. doi:10.4103/1673-5374.230303
8.Bigford GE, Del Rossi G. Supplemental substances derived from foods as adjunctive therapeutic agents for treatment of neurodegenerative diseases and disorders. Adv Nutr 2014;5:394-403. doi: 10.3945/an.113.005264
9.Borre YE, Panagaki T, Koelink PJ, et al. S: Neuroprotective and cognitive enhancing effects of a multi-targeted food intervention in an animal model of neurodegeneration and depression. Neuropharmacology. 2014;79:738-749. https://doi.org/ 10.1016/j. neuropharm .2013.11.009
10.Rahimifard M, Maqbool F, Moeini-Nodeh S, et al. Targeting the TLR4 signaling pathway by polyphenols: a novel therapeutic strategy for neuroinflammation. Ageing Res Rev. 2017;36:11-19. doi: 10.1016/j.arr.2017.02.004.
11.Wang ZX, Wang HF, Tan L, et al. HLA-A2 alleles mediate Alzheimer’s disease by altering hippocampal volume. Mol Neurobiol. 2017;54:2469–2476. doi: 10.1007/s12035-016-9832-3
12.Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Пер. с англ. под ред. И.В. Белозерцевой, Д.В. Блинова, М.С. Красильщиковой. Москва: ИРБИС, 2017:336 с.
13.Yin MM, Wang W, Sun J, et al. Paternal treadmill exercise enhances spatial learning and memory related to hippocampus among male offspring. Behav Brain Res. 2013;253:297–304. https: //doi.org/10.1016/j.bbr.2013.07.040
14.Frautschy SA, Hu W, Kim P, et al. Phenolic anti-inflammatory antioxidant reversal of Abeta-induced cognitive deficits and neuropathology. Neurobiol Aging. 2001;22(6):993-1005. https://doi.org/10.1016/S0197-4580(01)00300-1