CAESALPİNİA GİLLİESİİ YARPAQLARINDA FLAVONOİDLƏRİN TƏDQİQİ

09-12-2019

Açar sözlər: Caesalpinia gilliesii, flavonoidlər, spektrofotometrik analiz

Ключевые слова: Caesalpinia gilliesii, флавоноиды, спектрофотомет-рический анализ

Keywords: Caesalpinia gilliesii, flavonoidlər, spektrofotometrik analiz        

Azərbaycan florasında paxlakimilər fəsiləsinə aid bir çox bitki növlərinə rast gəlinir. Bu bitkilərdən biri də Caesalpinia gilliesii − Cillies sezalpiniyasıdır (şəkil1) [1]. Hazırda, elmi təbabətdə sezalpiniya cinsindən olan müxtəlif bitki növləri həm dərman bitki xammalı kimi, həm də  onlardan alınmış ofisinal dərman preparatları formasında geniş istifadə olunur.

Azərbaycan Respublikasının florasından olan həm yabanı, həm də becərilən dərman bitkilərinin fitokimyəvi öyrənilməsi, bu bitkilərin xammallarının və tərkib-lərindəki bioloji fəal maddələrin tədqiqi, onların əsasında səmərəli və daha effektiv dərman  vasitələrinin yaradılması əczaçılıq elminin qarşısında duran əsas aktual məsələlərdən biridir. Dərman bitkilərinin tədqiqinin bir neçə səbəbi var: bitki müxtəlifliyi haqqında bilik əldə etmək, bitkilərin xüsusi növlərindən dərman vasitəsi kimi səmərəli istifadə etmək, müvafiq fəaliyyətə malik daha aşağı dəyərli dərman bitkilərinin aşkar edilməsi, prototiplər üçün yeni  dərmanların aşkar edilməsi, ənənəvi dərman bitkiləri haqqında məlumat əldə etmək üçün. Son illər müxtəlif sezalpiniya növlərindən steroid birləşmələr, saponinlər, flavonoidlər, efir yağları və digər bioloji fəal birləşmələr alınmışdır [3-11].

Tədqiqatın məqsədi Azərbaycanda becərilən cillies sezalpinayasının yarpaqlarının tərkibində flavonoidlərinin tədqiqini həyata keçirməkdir.

Tədqiqatın material və metodlarıAparılmış ilkin fitokimyəvi tədqiqatlar nəticəsində cillies sezalpiniyasının yarpaqlarının tərkibində polisaxaridlər, aşı maddələri və flavonoidlər aşkar edilmişdir. Tədqiq olunan bitkinin yarpaqlarının tərkibində əsas bioloji fəal birləşmələrin bir qrupunu flavonoidlərin təşkil etdiyini nəzərə alaraq, onların eynilik və miqdari təyinatı həyata keçirilmişdir.

Sezalpiniya yarpaqlarında eynilik reaksiyaları və xromatoqrafik analiz üçün flavonoidləri ayırmaq lazımdır. Bunun üçün kolbaya 3-5 qr xırdalanmış bitki xammalı tökülür, üzərinə 30-50 ml 70 %-li etil spirti əlavə edilir. Kolba əks soyuducuya birləşdirilir və su hamamı üzərində 20-30 dəq müddətində qızdırmaqla ekstraksiya aparılır. Çıxarış soyudulur, 4 qat tənzifdən və ya kağız süzgəcdən süzülür. Diametri 1 sm olan və 1 qr poliamidlə doldurulmuş şüşə boru 50 ml su ilə yuyulur. Alınmış süzüntü şüşə boruya keçirilir və flavonoidlər 70 %-li etil spirti ilə elyuə edilir. Sarı rəngə boyanmış fraksiyalar toplanılır. Alınmış elyuat ½ həcmi qədər buxarlandırılır və qalan qalıq keyfiyyət reaksiyalarına və xromatloqrafik analizə sərf olunur. Müqayisə üçün 0,1 %-li rutinin spirtli məhlulu istifadə edilir. Reaksiyaların nəticələri 1 saylı cədvəldə verilmişdir.

     

Şəkil 1. Cillies sezalpiniyası bitkisi

Sezalpiniya bitkisinin xammalında flavonoidlərin  analizi

Cədvəl № 1.

Flavonoidlərə aid keyfiyyət reaksiyalarının nəticələri

 

Sianidin reaksiyası. 1 ml çıxarışın üzərinə 2-3 damcı qatı xlorid turşusu və 1-2 çimdik maqnezium metalının qırıqları əlavə edilir. Qırmızı rənglənmə müşahidə olunur.

Brianta görə sianidin reaksiyası. Sianidin reaksiyasının rəngli məhluluna 1/3 hissəsi qədər oktanol və ya butanol əlavə edilir. Təbəqələşmə gedənə qədər su ilə durulaşdırılır, çalxalanır və piqmentlərin sulu və ya üzvi fazaya keçməsi müşahidə edilir. Qlikozidlərin piqmentləri suda qalır, aqlikonlar isə üzvi həlledici olan təbəqəyə keçir.

Qələvi ilə reaksiya. 1 ml çıxarışa 1-2 damcı 10 %-li kalium-hidroksidin (natrium-hidroksidin) spirtli məhlulu əlavə edilir. Məhlul sarı rəngə çalır və ya təbii rəngi daha da güclənir.

Alüminium-xloridlə reaksiya. 1 ml çıxarışa 1 ml alüminium-xloridin 2 %-li spirtli məhlulu əlavə edilir. Müvafiq rəng müşahidə edilir.

Dəmir (III)-xloridlə reaksiya. 1 ml çıxarışın üzərinə 2-3 damcı dəmir-xloridin spirtdəki 1 %-li məhlulundan əlavə edilir. Flavonoidlərin sinfindən asılı olaraq tünd-yaşıl və ya qəhvəyi rəng müşahidə edilir. Vilson reaksiyası. 2 ml çıxarışın üzərinə 1 ml 2 %-li bor turşusu məhlulu və 1 ml 2 %-li limon (turşəng) turşusunun spirtli məhlulu əlavə edilir. 5-oksiflavon və 5-oksiflavonollar olduqda parlaq-sarı rəng müşahidə edilir.

Qatı xlorid turşusundakı vanilinlə reaksiya. 1 ml çıxarışa bir neçə damcı vanilinin qatı xlorid turşusundakı 1 %-li məhlulu damızdırılır. Ekstraktda olan flavonoidlərin sinfindən asılı olaraq müvafiq rəng müşahidə olunur.

Flavanonlar və flavanonollar natrium-borhidridlə reduksiya olunur və nəticədə tünd-qırmızı, bənövşəyi və ya göy rəngli məhlullar əmələ gətirir.

 İzoflavonoidlərin təyini üçün sezalpiniya xammalının 0,2 qr-a yaxın tozu həcmi 25 ml olan cilalanmış kolbaya tökülür, üzərinə 5 ml 70 %-li etil spirti əlavə edilir və əks soyuducuya birləşdirmək şərtilə qaynar su hamamı üzərində 20 dəq qızdırılır. Məhlul soyuduqdan sonra süzgəc kağızından süzülür. Süzgəc kağızı zolağına mikropipet vasitəsilə 0,05 ml çıxarış damızdırılır və UB-işıqda baxılır. Mavi flüoressensiya müşahidə edilməlidir. Ləkəni ammonyak buxarı ilə işlədikdə flüoressensiya güclənməlidir (izoflavonoidlər). Lakin, heç bir flüoressensiya müşahidə olunmamışdır.

Flavonoidlərin xromatoqrafik analizi

Bitki  materiallarında  flavonoidləri aşkar etmək   üçün  kağız xromatoqrafiyası, nazik  təbəqə üzərində xromatoqrafiya və qaz-maye xromatoqrafiyası üsullarından da geniş istifadə edilir. Xromatoqramda flavonoidlərin aşkar olunması ultrabənövşəyi işıqda baxmaqla  həyata  keçirilir. Bu  zaman,  flavon,  flavonol-3-qlikozid, flavonon,   xalkonlar qəhvəyi ləkə şəklində, flavonol və onların 7-qlikozidləri sarı və ya  sarımtıl-yaşıl ləkə, ksantonlar isə narıncı rəng əmələ gətirir.

Sezalpiniya yarpaqlarından alınmış spirtli çıxarış 15 %-li sirkə turşusu və butanol-su-sirkə turşusu (4:1:2) həlleidici sistemində xromatoqrafiya edildi. UB-işıqda xromatoqramlara baxdıqdan sonra onları daha parlaq  flüoressensiya verən sahələr almaq  məqsədilə müəyyən reaktivlərlə işləmək lazımdır (3-5 dəq, 105 ⁰C  qızdırmaq;  AlCl₃-in 5 %-li spirtli məhlulu; SbCl₃-in karbon-4-xloriddəki məhlulu, qələvinin 5 və ya 10 %-li spirtli məhlulu). Bu reaktivlərlə işlədikdə, UB-işıqda daha parlaq flüoressensiya əldə edilir.

Beləliklə, tədqiqat nəticəsində müəyyən edildi ki, sezalpiniya yarpaqlarının tərkibində 3 fərdi flavonoid vardır ki, onların da 15 %-li sirkə turşusu sistemində R_f-ləri 0,20; 0,53 və 0,73 və həmçinin butanol-su-sirkə turşusu sistemində müvafiq olaraq 0,25; 0,36 və 0,54 olduğu təyin edilmişdir.

Sezalpiniya bitkisinin yarpaqlarında flavonoidlərin spektrofotometrik üsulla

miqdari təyini

Bioloji fəal maddələrin miqdari təyinatındaspektrofotometrik üsuldan geniş istifadə olunur. Bu üsul  alınan nəticələrin daha dürüst olması və prosesin tez başa gəlməsi ilə fərqlənir. Deyilənləri nəzərə alaraq, sezalpiniya bitkisinin xammalının tərkibində olan flavonoidlərin miqdarı təyinatını spektrofotometrik üsulla yerinə yetirdik. Bunun üçün bitkinin xammalını xırdaladıq və məsamələrinin diametri 1 mm olan ələkdən keçirtdik. Xırdalanmış xammaldan 1 qr-ı (dəqiq kütlə) 150 ml-lik ölçülü kolbaya tökdük və üzərinə tərkibində 1 % qatı xlorid turşusu olan 30 ml 90 %-li etil spirti əlavə etdik. Kolbanı içindəkilərlə birlikdə əks soyuducuya birləşdirdik və qaynar su hamamı üzərində 30 dəq müddətində qızdırdıq. Sonra isə kolbadakı məhlulu otaq temperaturuna kimi soyutduq. Soyutduqdan sonra məhlulu kağız süzgəcdən həcmi 100 ml olan kolbaya süzdük. Yuxarıda qeyd olunan üsulla ekstraksiya prosesini ikinci və üçüncü dəfə təkrarladıq. Bütün çıxarışları   birləşdirdik və kağız  süzgəcdən  kolbaya  süzdük.  Sonra  süzgəci  90 %-li etil spirti ilə yuduq və süzüntünün həcmini 90 %-li  etil  spirti  ilə  ölçüyə çatdırdıq (A məhlulu).

     25 ml həcmə malik olan ölçülü kolbaya 2 ml A məhlulu tökdük, üzərinə alüminium-xloridin 95 %-li etil spirtindəki 1 %-li məhlulundan 1 ml əlavə etdik və məhlulun həcmini 95 %-li etil spirti ilə ölçüyə çatdırdıq. 20 dəq-dən sonra spektofotometrdə 430 nm dalğa uzunluğunda, qatının qalınlığı 10 mm olan küvetdə məhlulun optiki sıxlığını ölçdük (şəkil 2). A məhlulundan 2 ml 25 ml-lik ölçülü kolbaya tökdük, ölçüyə çatana qədər üzərinə 95 %-li etil spirti əlavə etdik. Alınmış məhlulu müqayisə məhlulu kimi istifadə etdik.

Mütləq quru xammalda və kversetinə əsasən hesablanmış flavonoid məcmuyunun faizlərlə miqdarını (X) aşağıdakı düstura əsasən təyin etdik:

 

      Burada:       D- tədqiq olunan məhlulun optiki sıxlığı;

         762,6- kversetinin alüminium-xloridlə kompleksinin 430 nm dalğa 
 uzunluğunda xüsusi udma göstəricisi;

          m- xammalın çəkisi, qr-la;

          W- xammalın qurudulması zamanı çəkidə itki, %-lə.

          Sezalpiniya bitkisi üçün W= 12,8 % olmuşdur.

Alınmış nəticələr 2 saylı cədvəldə verilmişdir. Nəzərə almaq lazımdır ki, spektrofotometrik üsulla miqdari təyinat 6 dəfədən az olmamaqla həyata keçirilməlidir.

  

Şəkil 2. Sezalpiniya yarpağının spirtli məhlulunun udma spektri

 Aparılmış spektrofotometrik tədqiqat nəticəsində müəyyən etdik ki, sezalpiniya bitkisnin yarpaqlarında  0,72 % flavonoid məcmuyu vardır.

 

Cədvəl № 2.

Sezalpiniya xammalında flavonoidlərin miqdari təyininin nəticələri (n=6)

Bitkinin xammalı	Flavonoidlərin miqdarı, %-lə	Metroloji xarakteristika
Yarpaqları	0,717 0,718 0,718 0,719 0,720 0,721	X= 0,72%; S=0,002; Sx=0,00082;  ea=0,00211; A=±0,2935 %

 

Nəticələr və onların müzakirəsi

Qeyd etmək lazımdır ki, statistik işləmələrdə düzgün nəticə almaq üçün flavonoidlərin miqdari təyinatı 6 dəfədən az aparılmamalıdır. Kversetinin standart nümunə məhlulunun hazırlanması belə həyata keçirilmişdir: 0,05 qr (dəqiq çəki) standart kversetin nümunəsi qabaqcadan 130-135 ⁰C temperaturda 3 saat müddətində qurudulur. Həcmi 100 ml olan ölçülü kolbada 85 ml 95 %-li etil spirtində qızdırmaqla həll edilir. Soyudulur, miqdari cəhətdən 100 ml-lik ölçülü kolbaya keçirilir, kolbanın həcmi 95 %-li etil spirti ilə ölçüyə çatdırılır və qarışdırılır.

Aparılmış spektrofotometrik tədqiqatlar nəticəsində müəyyən edilmişdir ki, sezalpeniya bitkisinin yarpaqlarında 0,72 % flavonoid məcmuyu vardır. Həmçinin, miqdari təyinatda alınmış nəticələrin statistik işlənməsi həyata keçirilmişdir [2].

Yekun. Yerinə yetirilmiş fitokimyəvi tədqiqat nəticəsində müəyyən edilmişdir ki, Cillies sezalpiniyası bitkisinin yarpaqlarının tərkibində 3 flavonoid vardır, onların n-butanol-su-sirkə turşusu (4:1:2) sistemində R_f-ləri 0,25; 0,36 və 0,54, həmçinin 15 %-li sirkə turşusu sistemində müvafiq olaraq 0,20; 0,53 və 0,73 olması müəyyən edilmişdir. Spektrofotometrik analiz nəticəsində müəyyən edilmişdir ki, bitkinin yarpaqlarının tərkibində 0,72 % flavonoid məcmuyu vardır. Cillies sezalpiniyası bitkisindən fərdi flavonoidlərin alınması, alınmış flavonoidlər əsasında effektli fitovasitələrin yaradılması aktual və perspektivli məsələdir.

 

ƏDƏBİYYAT - ЛИТЕРАТУРА– REFERENCES:

 

1.Флора Азербайджана, Баку, Изд-во АН Аз ССР, в 8-х томах, т.6, с. 323-324.
2.Государственная Фармакопея СССР XI изд., Вып. 1, Общие методы анализа. МЗ СССР, Москва, 1987, 336 с.
3.Adewale Adewuyi, Ritimi Ayodele Oderinde. Fatty Acid Composition and Lipid Profile of Diospyros mespiliformis, Albizia lebbeck, and Caesalpinia pulcherrima Seed Oils from Nigeria // International Journal of Food Science, 2014, v.  22, p. 78-83.
4.Archana P., Tandan S.K., Chandra S., Lal J. Antipyretic and analgesic activities of Caesalpinia bonducella seed kernel extract  // Phytother. Res., 2005, vol. 19, p.  376-381.
5.Anagnostopulou M.A., Kefalas P., Papageorgiou V.P. et al. Radical scavenging activity of various extracts and fractions of sweet orange peel (Caesalpinia ferrea)  // Food Chem., 2006, vol. 94, p. 19-25.
6.Baldim Z., Carvalho B., Martineli P. et al. m The Genus Caesalpinia L. (Caesalpiniaceae): Phytochemical and Pharmacological Characteristics // Journal Molecules, 2012, v. 17(7), p. 7887-7902.
7.Bulbovas P., Moraes R.M., Rinaldi M.C. et al. Leaf antioxidant fluctuations and growth responses in saplings of Caesalpinia echinata Lam. (brazilwood) under an urban stressing environment  // Ecotoxicol. Environ. Saf., 2010, vol. 73, p. 664-670.
8.Jun H., Xiaoling Y., Wei W. et al. Antioxidant activity in vitro of three constituents from Caesalpinia sappan L.  // Tsinghua Sci. Technol., 2008, vol. 13, p. 474-479.
9.Shukla S., Mehta A., Mehta P. et al. Studies on anti-inflammatory, antipyretic and analgesic properties of Caesalpinia bonducella F. seed oil in experimental animal models  // Food Chem. Toxicol., 2010, vol. 48, p. 61-64.
10.Yodsaoue O., Karalai C., Ponglimanont C., Tewthkul S., Chantrapromma C. Potential anti-inflammatory diterpenoids from the roots of Caesalpinia mimosoides Lamk  // Phytochemistry, 2010, vol. 71, p. 1756-1764.
11.Zanin J.B., Massoni M. et al. Caesalpinioflavone, a New Cytotoxic Biflavonoid Isolated from Caesalpinia pluviosa var. peltophoroides // Journal of the Brazilian Chemical Society, 2015, vol. 26, N 4, p. 212-118.