BAKTERİYALARIN ÇOXALMA KİNETİKASININ ABSORBSİON SPEKTROSKAPİYA METODU İLƏ ÖYRƏNİLMƏSİ.

31-10-2019

Kлючевые слoвa:микроорганизмы, кинетика, рост бактерии, абсорбционная спектроскопия, пламенный фотометр, химическая интерференция.      

       Для определения концентрации микроорганизмов в культуральной среде используются различные методы:

- прямой подсчет колоний в питательной среде на чашке Петри;

- определение объема осадка после центрифугирования;

- определение объема газа, образовавшегося в результате дыхания.

Эти методы, вообще говоря менее распространены, чем фотометрические. Помутнение культуральной среды можно зарегистрировать только при концентрации 10⁶ клетка ^. см^-3, а рост бактерий приостанавливается при концентрации примерно 10⁹ клетка ^. см^-3 [1].

Для определения концентрации клеток снимают зависимость пропускания культуральной средой света с данной длиной волн от времени, или, что эквивалентно, измеряют оптическую плотность, которая пропорциональна концентрации:  (закон Бэра), где  к – единая константа для всей кривой. В случае суспензий микробов этот закон справедлив только при DНа практике обычно используют красный свет, поскольку он не поглощается питательной средой, в которой растут клетки. Этот фактор является решающим, несмотря на слабую чувствительность детектора в данной спектральной области [2].

Рост бактерий. Рассмотрим микробную культуру с начальной концентрацией, скажем, N₀ клетка ^. см^-3. В момент времени t, когда совершилось n делений, концентрация будет равна N=N₀2ⁿ (геометрическая прогрессия со знаменателем 2). Если q- среднее время между делениями , то закон роста можно записать как  или  т.е. в виде  где А и В – постоянные коэффициенты для данной культуры. Таким образом, логарифм концентрации клеток растет линейно во времени. Этот закон выполняется для очень многих систем[3-4]. При добавлении различных веществ в культуральную среду характер роста меняется, как это видно из рис.1. Кривая I на этом рисунке соответствует описанному выше

Рис. 1. Кривая I на этом рисунке соответствует описанному выше нормальному росту; кривая  II  отвечает ситуации, когда вводимый в среду препарат убивает клетки и рост прекращается (насыщение); кривая III отражает введение вещества, временно останавливающего рост (появление ступеньки); кривая IV  соответствует лизису клеток под действием введенного препарата (максимум на кривой); кривая V отражает изменение скорости роста (изменение  наклона): это классический случай действия сульфамидов.

нормальному росту; кривая  II  отвечает ситуации, когда вводимый в среду препарат убивает клетки и рост прекращается (насыщение); кривая III отражает введение вещества, временно останавливающего рост (появление ступеньки); кривая IV  соответствует лизису клеток под действием введенного препарата (максимум на кривой); кривая V отражает изменение скорости роста (изменение  наклона): это классический случай действия сульфамидов. При введении препаратов, которые, подобно пенициллину, вызывают лизис, наблюдаются кривые с колебаниями. Построение кривых lgN=f(t) с помощью спектрофотометра позволяет определить содержание антибиотиков и антисептиков. В большинстве случаев сразу после высева бактерий на культуральную среду «нормальный» закон не выполняется. Сначала наблюдается фаза роста, называется стационарной, при которой кривая числа клеток представляет собой небольшое плато. Далее наступает фаза ускоренного роста, отвечающая нормальному закону, затем фаза замедленного роста, и, наконец, наблюдается выход на плато, отвечающий прекращению роста. Последнее может быть вызвано истощением питательных веществ, накоплением токсичных продуктов метаболизма или изменением pH среды до значений, при которых рост становится невозможным[5].

Иногда наблюдаются две фазы «нормального» роста, отличающиеся одна от другой наклоном прямой и ее протяженностью, разделенные плато той или иной длины.

Промежуточные плато соответствует адаптации микроорганизмов ко второму питательному веществу (рис. 2).

Рис. 2Явление характерно для культуральных сред, содержащих два питательных вещества с разным временем превращения.

Пламенная спектроскопия.

В спектрофотометрии сущест-вуют измерения двух основных типов: измерения спектров испускания и спектров поглощения. Гораздо более распространенным является первый из них, который к тому же, безусловно, более удобен в работе[6].

В 1860 г.Бунзен, проведя спектрофометрические исследования пламени соответственно красную и голубую окраску. Перед началом второй мировой войны эти методы стали использоваться в промышленном масштабе для анализа минеральных удобрений: содержание калия определялось по спектру испускания образца, фосфора – по спектру поглощения.

К началу 60-х годов спектрофотометрический анализ стал несравненно более точным методом. Чем химический микроанализ, особенно применительно к биохимии и биологии. Как и в любом анализе, очень важным здесь оказываются два условия:

а) воспроизводимость результатов, требующая совершенной аппаратуры и тщательной градуировки;

б) наличие взаимно-однозначного соответствия между показаниями прибора и определяемой концентрацией элементов.

Невыполнение второго условия может быть обусловлено целым рядом причин:

- химической интерференцией (см. ниже);

- присутствием в препарате примесей (например, Na), которые могут привести к искажению результатов;

- нестабильностью pH исследуемого раствора (так, добавление  малого количества соляной кислоты к раствору NaCl , особенно концентрированному, который является в сущности раствором ионов в Na⁺ и Cl^- , приводит  к уменьшению количества Na⁺ , а значит, и интенсивности линий дублета натрия (589,3 нм)[7].

Эти эффекты тем сильнее, чем ниже температура пламени, поэтому опытный экспериментатор, прежде чем делать выводы, сначала тщательно исследует влияние условий опыта на полученные результаты; в этом состоит тонкость метода пламенной спектроскопии при всей его кажущейся простоте.

Если спектр исследуемого элемента состоит из небольшого числа полос, достаточно регистрировать интенсивность лишь одной, характерной для данного элемента или интерференционные фильтры, но необходимо тщательно следить за тем, чтобы свет падал нормально к поверхности фильтра, в противном случае может измениться длина волны проходящего света[7].

Когда спектр состоит из большого числа полос, применение cветофильтров с широкой полосой пропускания не дает нужного результата – требуется устройство, которое обладает значительной дисперсией, позволяющей избежать наложения полос. Таковыми является призменный и решеточный монохроматоры.

Определение содержания многих элементов, для которых наблюдается явления химической интерференции, производится при помощи внутреннего эталона, который помещают в фотометр для определения содержания Na и К. Если нужно установить содержание лишь одного элемента, проще всего прибегнуть к линейной интерполяции. Приняв, что интенсивность испускае-мого света прямо пропорциональна концентрации данного соединения, в фотометр последовательно помещают: а) эталонный раствор этого соединения заведомо меньшей концентрации c₁ ; б) анализируемый раствор концентрации c_х ; в) эталонный раствор большей концентрации c₂ . Это позволяет легко найти c_х .

Пламенный фотометр

Принцип действия. При фиксированной длине волны (характерной для данного элемента) измеряют интенсивность излучения, индуцированного тепловым возбуждением атомов этого элемента.  Когда имеют делом с растворами солей металлов, их выпаривают в пламени; интенсивность излучения пропорциональна числу излучающих атомов и, значит, концентрации данного элемента в выпаренном растворе. Этот метод дает превосходные результаты при определении концентрации щелочных металлов и вполне пригоден для определения содержания щелочноземельных металлов (особенно просто определяется содержание Na и K)[8].

Внутренний эталон. Спектр испускания может искажаться вследствие изменения температуры пламени при выпаривании образца, изменения количества распыляемого раствора, а также из-за химической интерференции. Для устранения последней к образцу добавляют внутренний эталон – литий, по отношению к которому определяют содержание Na и К.

Устройство прибора. Пламенный фотометр включает – горелку, которая должна быть отрегулирована так, чтобы окислитель и горючее смешивались в строго постоянном отношении, сгорание было полным, а температура пламени была предельно высокой (отсутствие избытка окислителя);

- распылитель для подачи анализируемого раствора в пламя в виде аэрозоля; распылитель должен быть отрегулирован таким образом, чтобы пламя не было слишком холодным; высокая температура необходима для эффективной диссоциации молекул и комплексов на нейтральные атомы, а также для возбуждения количества атомов, достаточно для получения измеримой интенсивности излучения; обычно применяют смесь бутана (или пропана) и воздуха; температура пламени при этом составляет примерно 2000⁰С, что значительно меньше потенциала ионизации, но превышает энергию ионной связи;

- различные приспособления, например пылеулавливателя, регулятор отношения «давление горючего/давление окислителя», которое должно составлять определенную величину, зависящую от давления горючего; важными элементами конструкции являются фотоэлементы. Пучок света, излучаемого пламенем, падает после разделения на три интерференционных фильтра, отрегулированных в соответствии с характерными для анализируемых элементов и эталона длинами волн (589,3 нм для Na , 766,0 нм для К и 671,0 нм для Li). За каждым фильтром находится фотоэлемент, ток в котором пропорционален интенсивности падающего на него света.[8]

Измерительные схемы устроены таким образом, что направление токов, соответствующих Na и К, противоположно току от Li. Сведения о каждом из результирующих токов поступают на ЭВМ, преобразующих их в числовые данные, так что можно сразу считывать относительное содержание Na и К.[9-10]

Остановимся на явлении химической интерференции. Пусть имеет место ионизация при возбуждении Na дает дублет с центром при 589,3 нм, а у Na⁺ излучение в этой области отсутствует. Аналогичный  процесс протекает и в случае калия, следовательно добавление этого элемента эквивалентно добавлению электронов, что уменьшает долю ионизированного натрия, а значит, увеличивает интенсивность дублета при 589,3 нм. Иными словами, создается впечатление, что содержание Na выше, чем оно есть на самом деле. Метод внутреннего эталона устраняет этот источник ошибок.[11-13]

Javanshir.rahimov @ mail.ru

 

ƏDƏBİYYAT - ЛИТЕРАТУРА– REFERENCES:

 

1. Elements de biophysique,t. I par F.Gremy et F.Leterrier; t. II par F. Gremy et J. Perrin, Paris, Flammarion ed., 1975

2. Physique et biophysique (PCEM) par L.Gougerot, Paris,Masson ed., 1973.

3. Problemes physiques dans les systemes biologiques, cours donne aux Houches (ete 1969) publie par C.Dewitt et J.Matricon, New York, Londres,Paris, Gordon and Breach Science publischers, 1969.

4. Biophysique moleculaire par D.Chapmann et R.B.Leslie, Paris, Dunod ed.,coll. “Sciences poche”, 1970.

5. Introduction a la chimie macromoleculaire par G.Champetier et L.Monnerie, Paris, Masson ed., 1969.

6. Applications de la thermodynamique  du non-equilibre par P.Chaptier,  M.Gross et K.S.Spieler, Paris, Hermann ed., 1975.

7. The physics of liquid crystals par P.G.de Gennes, Oxford,Clarendon Press ed., 1975.

8. L’eau et les systemes biologiques, Colloque international de Roscoff (1975) par A.Alfsen et A.J.Berteaud, Ed. du CNRS, 1976

9. Structure et dynamique conformationnelle des proteines par J.Yon, Paris,Hermann ed., coll. “Methodes”, 1972.

10. Hansch C., Kunip A., Gard R., Gao H. Chem-bioinformatics and QSAR: A review of QSAR tasking positive hydrophobic terms // Chem. Rev. 2001. № 3. P. 619-672.

11. Mercader A., Castro E.A., Toropov A.A. Maximum topological distances based indices as molecular descriptors for QSPR. Modeling the enthalpy of formation of hydrocarbons from elements // Int. J. Mol. Sci. 2001. № 2. P. 121132.

12. Hawkins D.M., Basak S. QSAR with few compounds and many features // J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2001. V. 41. № 3. P. 663-670.    

13. Дж.А.Рагимов.//Молекулярная структура и макроскопические свойства макромолекул. Баку, Елм, 2002.